把单元连起来之前，先决定谁和谁连接
一串项链只要把珠子穿在线上就能成形，但合成一条指定顺序的多肽远不止把氨基酸混在一起。假设目标是由甘氨酸、丙氨酸和赖氨酸按固定顺序连接的短链，每个氨基酸都有可以参与连接的端基，赖氨酸的侧链又额外带有一个氨基。如果让所有这些位置同时反应，可能得到不同方向、不同长度甚至带有支链的产物。合成化学需要解决的首要问题，是让某一时刻只有计划中的两个位置建立连接。理解这一点，就能看懂保护基、活化剂和固相载体为何出现，也能明白制作一条指定序列与制造一批具有某种平均组成的聚合物有何不同。
多肽是氨基酸残基通过肽键连接的链，较长、能够形成特定组织与功能的肽链通常归入蛋白质的讨论。肽键属于酰胺键，由一个残基的羰基碳与另一个残基的氮相连；羰基是碳与氧以双键连接的基团。链的一端通常是氨基端，叫N端，另一端是羧基端，叫C端，序列按N端到C端书写。这里的“顺序”有明确方向，好像一条有入口和出口的生产线，不能只看用了哪些部件。端基还可以另外修饰，例如C端形成酰胺，或N端被乙酰化；这些变化会改变分子的组成、电荷或与环境的接触。
化学合成的一个用途，是把结构问题转化为可比较的样品。若想知道某个残基是否影响结合，可以制备只在这一位置不同的两条肽，再在相同条件下比较。若想了解某个修饰的作用，也可以控制修饰的位置与数量。这样的实验设计依赖样品身份清楚，而不仅是某个反应产生了含氮的固体。另一方面，用氨基酸衍生物进行聚合，可以获得主链类似蛋白质、但链长和排列按聚合规律分布的材料；它服务于另一类问题，如改变链的平均长度、侧链比例或整体组装行为。两类合成都重要，选择哪一种取决于想控制的结构层次。
本章把指定序列的合成拆成四个相互联系的任务：选择参与反应的位置，使这两个位置能够顺利成键，在反复操作中保存正确的链，最后确认产物的身份。保护与活化属于化学选择性问题，过滤、洗涤和树脂溶胀属于分离与传递问题，多步收率属于数量累积问题，而质谱、色谱和结构检查回答最后的质量问题。沿着同一条短肽的增长过程观察这些任务，可以看到分子反应、聚合物载体和实验流程怎样共同决定最终样品。
活化与保护：给反应安排入口和出口
先看肽键为什么需要专门的成键方法。一个胺的氮原子可以提供一对电子，与合适的缺电子中心建立新键，因此常被称为亲核体；酰基中的羰基碳是可被进攻的位置之一。可是把普通羧酸与胺直接放在一起时，常见的快速过程是质子转移，形成铵盐与羧酸根，而不是直接高效得到指定的酰胺。要使目标连接在合适条件下发生，通常把羧基转换成更容易发生酰基转移的形式，同时给将要离开的部分安排合适的去路。这种改变反应能力的处理叫作活化。
为了看清活化以后究竟换了哪根键，先把参加偶联的两部分分别记作A和B：A是待接入残基中与羧基相连的其余部分，B是带有开放氨基的已有肽链或氨基酸部分；它们是整块分子片段的标签，不是原子符号。羧基可写成A—C(=O)—OH，胺写成H₂N—B，其中C、O、N、H分别表示碳、氧、氮、氢，短线与等号表示单键和双键。目标产物是A—C(=O)—NH—B。羰基碳的位置没有更换，改变的是它连接的含氧部分被含氮部分取代。这类反应叫亲核酰基取代，关键在于胺能否顺利接近，以及原来的含氧部分能否作为离去基团离开。
把合适的活性酯写成A—C(=O)—O—X，X表示所选活性酯中离去部分的其余结构。胺的氮用一对电子与羰基碳建立新键时，原先碳氧双键中的一对电子移向氧，使该碳暂时形成四个单键，进入四面体中间体。图中的O⁻和NH₂⁺分别标出这一阶段氧与氮的形式电荷；它们不是新增加了两个原子，而是电子分配改变后的记号。随后经过质子转移，氧重新形成碳氧双键，原来的含氧基团离开，得到酰胺和相应的HO—X。质子可由周围碱、酸或其他分子传递，实际先后次序随体系而变；图把这些传递合并，突出“加上氮—暂时打开双键—重建双键并释放离去部分”的成键主线。
碳二亚胺为准备这种活化连接提供了一条经典路线。John Sheehan与George Hess在1955年报道的DCC肽键形成方法，把羧基的原位活化与胺的偶联接在一起。DCC的全名是N,N′-二环己基碳二亚胺，中间的反应结构为N=C=N，两端各连一个环己基；环己基是由六个碳组成的饱和环上去掉一个氢后留下的基团，图中缩写为Cy。羧酸与DCC通过质子转移和羧酸根氧的进攻，形成O-酰基异脲：原羧基通过氧连到DCC原来的中央碳上。名称中的O说明酰基经氧连接，读结构图时沿A—C(=O)—O这段追踪，便能找到这个关键中间体。
O-酰基异脲形成以后，有几条途径在竞争。目标胺进攻来自氨基酸的羰基碳，可以给出肽键；DCC部分经过离去和质子、键的重新安排，成为N,N′-二环己基脲，简称DCU。脲的中心结构是一个羰基碳连着两个氮，DCU的两个氮再分别带着Cy。另一条途径是中间体内部的酰基从氧转移到氮，形成N-酰基脲。这个产物把待连接的酰基留在偶联试剂的衍生物上，在通常的偶联条件下不再有效地向目标胺传递，因而消耗了原料，却没有延长目标肽链。DCU是成功偶联可同时生成的副产物，N-酰基脲则代表酰基走入竞争支路，两者不能因为名称都有“脲”便看成同一种结果。
添加剂的作用可以沿着这个分岔继续理解。某些适合的含羟基添加剂能在O-酰基异脲重排之前接走酰基，生成供目标胺继续反应的活性酯；历史上常用的例子包括1-羟基苯并三唑，缩写HOBt。这里“接走”不是把目标基团丢掉，而是换一种临时连接方式，让它仍能被胺取代。合适的活性酯未必比O-酰基异脲对所有进攻都反应更快，却可以减少某些竞争路径，把更多原料导向所需肽键；任意一种醇也不会自动具有同样效果。若中间体与另一分子羧酸根反应，还可能形成仍能传递酰基的酸酐。因此，反应效率由多条路径的相对快慢决定，偶联剂、添加剂、溶剂、保护方式和胺端的可接近性需要一起考虑。
活化解决“让计划中的位置能够反应”，保护则解决“让其他位置暂时不反应”。如果准备让新加入氨基酸的羧基与已生长链的氨基连接，新单元自己的氨基必须暂时关闭，否则可能继续与其他活化单元发生连接。带有氨基、羧基、巯基或羟基的侧链，也可能需要适合的保护。保护基是与某个基团形成可逆化学连接的部分，它改变该位置的反应性；在需要恢复功能时，再用预先设计的条件将它除去。保护不是给分子涂上一层均匀外壳，而是逐个位置选择性地改变化学行为。
保护基的选择包含一个时间顺序。用于链端氨基的临时保护，往往每延长一个残基就要除去一次；用于侧链的保护，则通常要在整条链组装期间保留，直到后面指定的步骤才去除。若每次打开链端时也同时打开侧链，后续偶联便可能连到错误位置。所谓“正交保护”，强调不同保护方式可以用相互区分的条件选择性处理。真正的方案还要考虑目标链本身、载体连接与其他修饰能否耐受这些条件，所以正交性属于整套化学体系的配合关系，而不是只凭两个保护基名称就能保证的性质。
保护基为什么改变了多肽合成的工作方式
几种常见氨基保护基可以帮助理解这种选择性。Boc是叔丁氧羰基，常利用酸性条件脱除；Cbz是苄氧羰基，经典脱除方式之一是催化氢解；Fmoc是芴甲氧羰基，具有可在适当碱性条件下脱除的特点。它们都能暂时降低目标氨基参与偶联的能力，但“打开”的化学方式不同。对刚接触有机化学的读者，可以先记住保护基提供可选择的开关，再逐步学习具体结构为什么对某类条件敏感。完整路线要让每一次开关只影响当前应该改变的部分，同时保留已经形成的肽键和后面仍需使用的连接。
1970年，Louis Carpino与Grace Han关于Fmoc基团的研究增加了一种有用的氨基保护选择：与许多依赖酸性条件去除的保护方式相比，它的碱敏感性使反复打开链端和保留其他受保护位置之间有了新的安排。这个历史节点的重要性在于选择性设计，而不仅是增加了一个缩写。若链端可以在一种条件下打开，侧链和载体连接可以在另一种条件下处理，整个多步过程就更容易按固定节奏组织。保护策略的发展也使不同序列、不同末端和不同修饰的肽能够使用更合适的组合路线。
羧基也可以通过形成酯等方式暂时保护。酯由羧酸部分与含氧基团连接而成，在选择的脱保护条件下再恢复需要的羧基。对于侧链含羧基的天冬氨酸和谷氨酸，必须区分侧链羧基与参与骨架连接的α羧基；对于赖氨酸，也必须区分骨架α氨基和侧链末端氨基。两种位置看起来都叫“羧基”或“氨基”，却承担不同的连接任务。如果目标中包含一个侧链分支或特定位点修饰，恰恰可以利用这种区分，先完成主链，再选择性打开那一个侧链位置。
保护还牵涉立体化学。除甘氨酸外，普通α-氨基酸的α碳连接四种不同基团，具有手性；两种互为镜像、却不能通过整体旋转重合的安排，类似左右手。L和D是按参照结构区分空间安排的名称，普通蛋白质多采用L型残基。若合成时一部分残基转成相反构型，已有肽链与新加入残基的空间配合便会改变，即使总质量仍然吻合，产物也可能具有不同的识别和组装行为。
立体构型为什么会在活化时改变？对于某些N端已酰化的氨基酸或肽片段，邻近的羰基氧可以与被活化的羧基发生分子内反应，形成含氧和氮的五元环中间体，称为噁唑酮。其靠近原α碳的位置在合适条件下较容易失去氢离子，电子重新分配后出现近似平面的结构；氢离子再加回来时，可以从平面的不同侧接近，于是原来的空间安排可能部分改变。这里被改变的是手性中心周围的排列，原子总数和分子质量可以保持不变。活性酯途径与合适保护方式能改变这些过程的竞争，减少中间体进入某些易发生立体变化的路线，但最终程度仍取决于残基、邻近结构和反应条件。
“消旋”与“差向异构化”也有不同的计数对象。一个只有一个手性中心的纯对映体逐渐产生另一种对映体、趋向两者等量的过程，称为消旋；多肽通常有多个手性中心，其中一个中心改变而其他中心保持不变，所得两者是差向异构体，彼此通常不是整个分子的镜像。合成时既要检查连接顺序，也要检查这种局部空间身份。总质量相同只能说明原子收支相符，无法单独分辨这些立体差别；采用能够区分相应异构体的分离或结构分析，才能把“接上了”进一步落实为“按计划接上了”。
在纸上安排路线时，一个实用办法是给每类位置分配清楚的任务：此刻开放的链端、此刻活化的羧基、整个增长阶段保持关闭的侧链，以及最后才释放的载体连接。随后逐步检查，每一次脱保护会影响哪些任务。这样的推理与复杂设备中的阀门安排相似：打开进料通道时，不能同时误开排料通道。分子的阀门由化学键与反应性实现，所以最后仍要回到各保护基的具体性质和目标序列，而不能只依靠图上的颜色判断能否实施。
把正在生长的链固定住：固相合成的想法
在溶液中逐步合成多肽，每一步之后都要面对一个现实问题：怎样把已经做好的中间体从多余原料和副产物中分出来。链变长以后，它的溶解性可能变化，结晶和分离也可能越来越困难。Bruce Merrifield在1963年的工作提出了改变分离方式的办法：把生长中的肽链以共价连接固定在不溶性聚合物树脂上，让可溶性试剂进入并反应，再通过过滤和洗涤除去游离组分。这样，中间体可以留在载体上继续下一轮，而不必每次都把它作为自由分子重新分离。
最常见的固相多肽合成方向，是先把目标序列的C端残基接到载体上，然后逐轮在开放的N端加入新残基。因此，目标序列虽然按N到C书写，实际装配常从C端向N端推进。例如，要得到N端为甘氨酸、C端为丙氨酸的Gly—Ala二肽，先固定丙氨酸，再把甘氨酸的活化羧基接到丙氨酸开放的氨基上。把书写方向与合成方向分清，就能避免在看流程图时把顺序反过来。其他固定方式与特殊增长路线也存在，但它们同样需要明确哪一个位置留在载体上、哪一个位置负责继续增长。
一轮增长通常包含打开链端、洗去脱保护相关组分、偶联下一个受保护单元，以及再次洗涤。洗涤的作用是把可移动的小分子带走，肽链则通过载体连接留在原处。若偶联没有在所有链端完成，单纯洗涤并不能把未反应的错误链从正确链中挑出来，因为它们都固定在树脂上；有时会选择重复偶联或对某些未反应端基封端。固相法因此把分离操作变得方便，却仍然依赖每一轮化学反应的完整性。理解这个区别，有助于解释为什么流程自动化以后，反应质量仍需要监测。
树脂“不溶”也不意味着反应物只停留在一颗硬球的外表面。许多载体是交联聚合物，在合适溶剂中吸收液体并溶胀，试剂可以进入内部的聚合物网络，接触附着的链。就像浸水的海绵可以让液体进入内部，溶胀提供了可到达的空间；不过树脂的孔隙、链段运动和溶剂亲和性有具体的分子基础。若树脂不充分溶胀，或正在增长的肽链彼此聚集，试剂到达反应位置就会变慢。此时外部液体中试剂很多，也不等于每一个内部链端都经历了相同的反应环境。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| tD | 扩散跨越距离L的特征时间 | s |
| L | 需要跨越的典型距离 | m |
| D | 有效扩散系数，描述分散运动的快慢 | m²/s |
| ∼ | 表示量级相当；具体几何会引入数值因子 | — |
怎样理解扩散由许多方向不断变化的小步组成，走过的净距离不像匀速直线运动那样随时间直接增加。典型距离的平方与扩散时间成比例，所以距离翻倍时，这个时间尺度约增至四倍。距离平方除以扩散系数，单位为秒。
算一个例子用示意参数L=50 μm=5×10⁻⁵ m，D=1×10⁻¹⁰ m²/s，得到t_D约为25 s。距离改成100 μm而D相同，时间尺度约为100 s。
使用条件这是均匀有效扩散的量级模型，用于理解距离与传递的关系。树脂几何、溶胀程度和化学反应会影响实际过程，t_D并不是偶联完成时间。
固定肽链的连接臂决定怎样把产物释放，也影响最后获得哪种末端结构。连接臂可以先理解为树脂与肽之间的一段可设计的桥：增长时足够稳定，在指定的释放条件下可以断开。不同连接臂可能用于得到羧酸末端或酰胺末端，也可以为特殊的环化或片段连接留下反应位置。选择树脂和连接臂因此是目标分子设计的一部分，而不是直到最后一步才考虑的包装问题。最终释放后，产物通常还需要分离和分析，把目标链与缺失序列、残余保护形式和其他副产物区分开。
为什么每一步都“差一点”会积成大问题
多步合成很适合用一个简单的数量模型建立直觉。假设开始时有很多条正确链，每一轮只有其中一部分沿计划中的路径完成增长。第一轮未正确完成的链不能自动被后面的步骤变回完全正确的序列；第二轮又会从剩余的正确链中损失一部分。因此，各轮保留下来的比例需要相乘，而不是把每轮的百分数相加。这个模型说明长链合成为什么特别在意单步质量：一轮中看起来很小的偏差，重复几十轮后可能显著改变目标序列在混合物中的比例。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| fm | 经历m轮后仍完整正确的链所占比例 | 1 |
| m | 需要考虑的增长轮数 | 1 |
| j | 标记某一轮的编号，从1到m | 1 |
| pj | 第j轮中原本正确的链继续正确的条件比例 | 1 |
| p | 每轮正确比例相同时的共同值 | 1 |
| ∏ | 将每一轮的比例连乘 | — |
| ⇒ | 左侧条件成立时得到右侧关系 | — |
怎样理解第二轮从第一轮保留下来的正确链中再保留一部分，因此使用乘法。写成条件比例时不要求各轮统计独立；只有把所有p_j设为同一个p，才得到相同因子的m次幂。幂表示把p重复相乘m次。
算一个例子先固定一个残基，再增长到50个残基，共49轮。若每轮p=0.99，则完整正确比例为0.99的49次方，约61.11%；若p=0.995，比例约78.22%。
使用条件按给定成功标准计数，且早期错误不会在后续被修复。它描述这一模型中的完整正确链比例；释放、纯化和转移造成的回收损失需要另行计入。
完整链的比例怎样改变
从已经固定的第一个残基开始，调节目标长度与每轮正确比例。曲线显示每轮之后仍完全正确的链，不包含后续纯化损失。
每轮正确比例是前一轮正确链继续保持正确的条件比例。初始载入残基作为起点，目标残基数减一得到增长轮数；曲线使用本节的连乘模型。
这里需要区分几个容易混淆的“收率”。偶联转化率描述某一步有多少反应位置发生了指定变化；正确序列比例进一步要求前面每一步也都正确；分离收率还包含后续切下、纯化和转移时回收了多少目标物。一个样品看起来“全部反应了”，也可能包含错误连接或立体构型变化。相反，纯化后得到的样品可能很纯，但回收到的总量较少。报告数字时把分子与分母说清楚，才能知道是在比较反应效率、混合物组成，还是最后真正拿到手的目标样品。
算式也帮助解释为什么研究者会把较长目标拆成几个较短片段。每个片段可以独立合成、纯化和鉴定，再在设计好的位置连接起来，使最后一个样品不必从头到尾经历所有小步。并行制作还可以缩短某条路线的最长连续操作阶段。不过，把32个残基分成小段并不会让最终所需的31个骨架连接凭空消失；材料消耗、片段制备收率、连接效率和纯化损失都仍要计入。片段法的优势要从可操作性、单个片段的质量和整条路线的物料收支来评价，不能只数流程图上画了几支箭头。
另一个有用的设计问题是：若希望经过很多轮之后仍保留某个目标比例，平均每轮要做到多好？这相当于从总比例反推单步要求。数学中的开方就是寻找一个数，使它重复相乘若干次后等于给定结果；指数是正向累积，开方是反向求条件。对于每一步质量相同的简化情况，这样就能把“尽量提高效率”变成一个明确目标，也能直观看到目标链越长，对单步过程的要求为什么越严格。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| prequired | 每轮需要达到的相同正确比例 | 1 |
| ftarget | 希望最终保留的完整正确链比例 | 1 |
| m | 增长轮数，为正整数 | 1 |
| 1/m | m次方根对应的指数 | 1 |
怎样理解若同一个比例连续乘m次要得到目标值，就对目标比例取m次方根。这是上一关系的反向计算。百分数须先除以100转为0到1之间的比例。
算一个例子49轮后希望保留50%的完整正确链，p_required=0.5的1/49次方，约0.98595，即每轮约98.60%。
使用条件适用于每轮使用同一有效正确比例的规划模型；若各轮不同，应使用逐轮比例的乘积。
长链的难处：化学副反应与分子接近
链越长，合成难度并不只因为步骤变多。正在生长的肽链可能通过氢键或非极性片段相互聚集，使某些链端藏在较难接近的位置；保护基增加的体积也会改变局部拥挤程度。可以把这种情况想成在一束互相缠靠的绳端上继续接扣子：外面看见的是许多绳端，真正能够接近工具的位置却不一定一样。分子体系中，这种差异由溶剂、序列、载体密度与温度共同影响。调整这些条件的目的，是让反应位点更均匀地接触到试剂，而不仅是把外部反应时间一味延长。
副反应则改变了分子的化学身份。羧基活化过程可能伴随某些中间体重排、侧链参与或手性中心变化；脱保护条件可能影响敏感残基或已有修饰；偶联不完全则可能留下少一个或几个残基的缺失序列。每一种问题都对应不同的诊断思路。若质量差值与某个残基相近，可以检查是否发生缺失；若总质量正确但色谱出现分离峰，仍可能存在序列位置、构型或其他等质量差异。分析的目的，是把“出现了杂峰”进一步变成能够追溯到某一步反应或分离过程的具体问题。
对较长蛋白质，Philip Dawson、Tom Muir、Ian Clark-Lewis和Stephen Kent在1994年报道的天然化学连接提供了一种重要的片段组装方式。经典形式利用一个片段的C端硫酯与另一个片段N端半胱氨酸的反应，先发生有选择性的硫酯交换，再经分子内酰基转移形成天然的酰胺骨架连接。这个过程把“让两个大肽段精确找到对方”与“最终连接仍属于普通肽骨架”结合起来。它适合说明化学选择性如何支持更大的分子组装，也说明多肽合成的方法边界会随着连接策略发展而改变。
化学连接完成后，蛋白质仍可能需要形成正确的二硫键、结合辅因子或经历折叠。链的序列正确，是认识结构和功能的重要起点，但最终状态还受环境与组装过程影响。可以把整条路线分成“得到正确的共价结构”和“建立所需的空间组织”两层：前一层关注残基顺序、末端、连接位点和修饰，后一层关注折叠、亚基接触与溶剂条件。这样的区分既能帮助设计检查方法，也能避免把“测到了正确质量”直接等同于“已经得到了具有目标功能的蛋白质”。
从一条序列到一组序列：多肽库怎样建立
有时研究目标是比较许多序列，而不是只制备一条。并行合成把不同目标放在不同位置或反应容器中，各自保留清楚的身份，适合有明确候选序列的比较；分割—混合合成则反复把载体分成若干份，让每份接上不同单元，再混合并重新分配，以较少的操作组合出大量序列。两者解决的问题不同，并行方法方便逐一追踪，分割—混合方法擅长扩大组合范围。选择时要同时考虑后续怎样测活性、怎样找回有用序列的身份，以及每个样品是否有足够的数量进行验证。
先做一个清楚的计数。若C端固定为丙氨酸，前面三个位置各自都可以在谷氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸之间任选一种，而且允许重复，那么第一个位置有三种选择，每一种又对应第二个位置的三种，第三个位置再乘三。这产生的是不同的有方向序列。若条件改成“三种残基必须各用一次”，计数就不同，因为某种残基被用过之后，后面可选的种类会减少。把“可选种类”和“每种必须出现的次数”区分开，才能准确解释一个肽库到底覆盖了哪些结构。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| Ω | 允许重复时可能的有方向序列数 | 1 |
| q | 每个可变位置可选的残基种类数 | 1 |
| n | 可变位置数；右式中也等于待排列的不同残基数 | 1 |
| Ωonce | n种不同残基各用一次时的序列数 | 1 |
| ! | 阶乘：从n逐个乘到1 | — |
怎样理解允许重复时每个位置始终有q种选择，连续n个位置相乘得到q的n次方。若n种残基各用一次，可选数逐步变成n、n−1直到1，得到阶乘。固定的C端不计入可变位置。
算一个例子三个位置各在E、F、K之间任选且允许重复，有3³=27种。如果三个位置必须各用一种，则有3!=3×2×1=6种。
使用条件按位置区分序列并固定书写方向，暂不计化学错误、端基变化与立体构型。组合可能数与实际微珠覆盖数需要分别考虑。
在理想的分割—混合过程中，一颗树脂微珠在每轮进入一个反应分组，因此它沿着一条增长路线形成一种主要序列；不同微珠则经历不同的路线。实际得到的序列种类还受到微珠总数、分配均匀程度和每轮反应质量影响。理论上有一百万种组合，不等于拿一百万颗珠子就一定把每一种都做到了：随机分配中，有些路线会重复，有些路线可能没有珠子走过。这与抽取盒子里的不同卡片类似，抽取次数等于卡片种类数时，仍容易出现重复卡片和未抽到的卡片。
这样的库可以用来寻找与某个目标相互作用的序列，但初步信号需要继续解释。微珠上的多条肽同时存在，可能产生与游离单条肽不同的多价结合；染色或荧光还可能受到载体本身或非特异吸附影响。一个清楚的研究路径是先定位响应的样品，确认序列身份，再单独制备并在合适条件下比较。这里关心的不是库越大越好，而是库的结构设计、检测问题与后续验证是否相互匹配；有针对性的一组序列，往往能比一个身份不清楚的巨大混合物更直接回答机制问题。
指定序列与聚合物分布：两种不同的控制目标
氨基酸也可以先转变成适合聚合的衍生物，再通过链增长获得多肽材料。N-羧酸酐常缩写为NCA，是这类化学中的重要单体；环打开并释放二氧化碳后，形成新的肽骨架单元，活性链端可以继续加入单体。这样的路线通常着重控制平均链长、分子量分布或单体组成，而不是逐个指定每一位置的残基身份。若同时加入两种不同单体，链内排列还与它们的反应性和加入方式有关；若按阶段改变进料，也可以设计不同的链段组织。认识控制目标的差别，能帮助我们为分子识别研究与材料组装研究选择各自合适的合成方式。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| X̄_n | 数均聚合度，即每条链平均含有的单体单元数 | 1 |
| pM | 单体转化率，以0到1的比例表示 | 1 |
| cM,0 | 初始单体物质的量浓度 | mol/L |
| cI,0 | 初始有效引发剂物质的量浓度 | mol/L |
| ≃ | 表示所列理想条件下的近似关系 | — |
怎样理解一摩尔表示固定数量的分子；浓度是每体积内有多少摩尔。单体转化率乘初始单体数量，得到已进入链的单元数，再除以生成的链数，便得到每条链的平均单元数。同一体积的两个浓度相除，体积和摩尔单位抵消。
算一个例子初始单体0.20 mol/L、有效引发剂0.0020 mol/L，单体转化率80%，则平均聚合度约为0.80×0.20/0.0020=80。
使用条件假设每个有效引发剂产生一条链，引发充分且较同步，没有显著链转移或额外引发，转化单体主要进入这些链。链端质量不计入聚合度；该平均值不指定每条链的精确长度或残基顺序。
平均链长还需要和样品中链条数量联系起来。假如同样数量的单体被分给更多条生长链，每条链平均能分到的单元就会减少；如果链条数量相同，却让更多单体完成反应，平均链长就会增加。这个关系像把相同数量的积木分给不同数量的小组，但实际引发是否充分、链是否中途转移，会改变真正参与分配的链条数。因此，投入的单体与引发剂之比给出一个设计起点，最终还要用分子量及其分布来认识实际样品。两批样品即使平均链长相同，也可能一批长度接近，另一批同时含有许多短链和少量很长的链，因而表现出不同的溶解和组装行为。
比较两条路线时，可以用“每次控制一个位置”和“通过聚合条件控制一个分布”来理解。前者愿意为明确的序列付出反复保护、脱保护、偶联和分离的工作，适合考察单点替换或特定位点修饰；后者利用连续链增长获得较多材料，再通过平均链长、组成和分布描述样品。两者还可以结合，例如先制备特定短肽，再把它接到另一种聚合物上，让精确的局部结构与较大的材料骨架共同发挥作用。分子设计的关键，是把需要精确控制的层次与可以接受统计分布的层次事先分清。
最后，怎样判断一条合成多肽已经达到研究要求？先检查目标身份：残基序列、末端结构、预定修饰和必要的立体化学是否相符；再检查样品组成：主要成分与其他组分如何区分，是否有与目标问题相关的残余杂质；如果研究功能或材料行为，还要检查折叠、组装和测试环境。色谱帮助分离不同组分，质谱对分子质量与碎片信息敏感，其他结构方法则补充构象或连接证据。把这些方法对应到具体问题，能够让“得到了产物”逐步变成“得到了身份清楚、适合回答这个问题的样品”。
想一想：每轮正确率为99%，为什么长链仍需要仔细分析？
因为完整目标序列要求前面的每一轮都正确，正确链比例随轮数按乘积累积下降。与此同时，99%的某一步转化率未必包含立体化学和所有连接位置的信息。最终还要区分缺失序列、等质量差异及释放纯化的损失。提高单步质量、设计可检测的中间节点，以及在需要时采用片段组装，可以从不同环节改善结果；具体选择取决于目标序列与希望回答的科学问题。
多肽合成把一个抽象的字母序列变成可拿来测量的分子，其中每一个保护、活化和分离步骤都在维护某种结构信息。树脂把正在生长的链留住，正交保护把不同位置的任务分开，数量模型提醒我们注意累积损失，最终分析则把合成过程与实际样品联系起来。沿着这些关系理解方法，就能进一步阅读蛋白质修饰、片段连接、肽材料组装和结构—功能实验，而不必先把所有试剂名称背成一张孤立的表。