从混合物中找到一种蛋白质：分离、鉴定与结构测量

找到目标，先要知道自己在找什么

牛奶、蛋清和细胞提取液看上去都是一种液体，里面却可能同时存在许多不同的蛋白质。假如想研究一种能够分解淀粉的酶，直接观察混合液中的反应，就会遇到一个困难：究竟是谁完成了反应，其他组分又起了什么作用？蛋白质分离的用途，是把这个模糊的问题变成可以测量的对象。我们希望从混合物中得到身份明确、数量合适、状态适合实验的目标分子。这里的“适合”很具体：研究催化需要关注活性，研究组装需要关注聚集状态，制备某种材料则还要关注残留物、浓度与批次差异。

分离的基本办法，是寻找目标与其他组分之间可利用的差别。大小不同，可以利用膜或多孔介质；电荷不同，可以利用带电表面或电场；与某种分子的结合能力不同，可以让这个分子帮助捕获目标。这像从混在一起的物品中逐步挑出一种物品，但分子之间的差别往往连续而细微，不像红球和蓝球那样容易一眼区分。因此，一种方法通常先减少某一类混杂，下一种方法再利用另一种性质继续分开。选择步骤的关键，是知道每一步利用什么差别，以及经过这一步之后样品会变成什么状态。

在真正开始分离之前，还需要一个能够追踪目标的方法。若目标是酶，可以在固定条件下测它使底物转变的速率；若有合适的抗体，可以检测抗体识别的部分；若知道序列和预期质量，可以使用相应的分析信号。追踪方法相当于在分离过程中携带一张身份证，但不同身份证记录的信息不同。活性回答某种功能是否存在，抗体回答某个可识别结构是否存在，质量与序列分析则提供化学身份线索。把几类信息配合起来，才能知道目标是否仍在、是否发生变化，以及该收集哪一部分液体。

纯度、回收率和活性是三个相关但不同的量。纯度关注样品中目标占多大比例，回收率关注最初的目标最终留下多少，活性关注在指定测量条件下能够完成多少功能。如果去掉了很多杂蛋白，同时损失一部分目标，纯度可以上升而回收率下降。对于一个酶，还可以计算每毫克总蛋白所对应的活性，称为比活性。它把样品的功能输出和蛋白总量联系起来，是判断一个分离步骤是否富集活性组分的有用指标，但它也会受到抑制剂、激活剂和测定条件的影响。

因此，一张清楚的纯化记录应同时保留各阶段的体积、蛋白量、目标量或总活性，以及测量所用条件。只看某一个峰变高，可能只是样品被浓缩；只看蛋白总量减少，也不知道被去掉的是目标还是杂质。把这些数量联系起来，才能判断下一步应当继续提高分辨率、先换一种缓冲环境，还是已经得到足够好的样品。所需纯化程度由具体用途和检测对象决定，研究样品与工业样品各有自己的质量要求，不能简单按用途名称把其中一类归为“可以不纯”。

让蛋白质进入溶液，也让它保留需要的状态

蛋白质原本可能位于细胞液中，也可能嵌在膜里、附着在结构骨架上，或已经形成颗粒。第一步不是一律把材料处理得越猛烈越好，而是根据所在位置把目标释放出来。细胞破碎改变了原先的空间隔离：目标蛋白会接触其他酶、膜碎片、核酸与新的溶液环境。蛋白酶能够切断肽链，暴露的非极性表面可能促使分子聚集，金属离子或辅因子的流失也可能改变功能。因此，释放、保持溶解与保存所需结构，是同一个前处理问题的不同侧面。

缓冲液的作用，是使溶液在受到少量酸或碱的影响时，酸碱程度不至于骤变。pH是描述氢离子有效浓度的尺度；这里的有效浓度考虑了溶液中相互作用对离子行为的影响，数值降低通常表示环境更酸；它会影响蛋白质上许多基团是否带电。盐离子改变电荷之间的作用范围，温度影响反应与分子运动的速度。对于膜蛋白，还可能需要能同时接触水和非极性部分的表面活性剂，使原本朝向膜内部的区域得到合适环境。每种添加物都有明确任务，同时也可能影响后面的分离和检测，所以前处理条件需要与整条路线一起安排。

离心常用来把较大的碎片与可溶组分分开。旋转使颗粒在液体中表现出向外沉降的趋势，沉降速度与颗粒质量、排开液体产生的浮力，以及运动时受到的阻力有关；阻力又与形状和大小有关。可以先把它想成让不同颗粒在同一条件下“跑一段路”，再观察它们所在的位置。这里需要区分两种密度梯度方法：速率区带离心主要利用一定时间内沉降速度不同形成分离；等密度离心则在合适梯度中进行到颗粒接近自身浮力密度的位置。前者不要求每一种颗粒都停在密度相等处，两种机制不应混为一个解释。

改变溶解度也能进行初步分级。例如增加某些盐的浓度后，一部分蛋白质可能先从溶液中析出，另一部分仍然溶解。盐既影响电荷屏蔽，也影响水与分子表面的相互作用；具体结果取决于盐的种类、浓度和蛋白质表面，不能只用“盐把水抢走了”概括全部过程。沉淀可以被重新分散或溶解时，这种差别就能帮助浓缩和分级。酸碱变化、有机溶剂或温度变化也会改变溶解性，但同时可能影响折叠与活性，因此是否能重新获得所需状态，要由目标蛋白和相应条件来判断。

等电点附近的现象尤其容易被误解。等电点是某种条件下蛋白质平均净电荷为零时的pH，此时许多蛋白质之间的总体静电排斥减弱，可能更容易靠近并聚集。然而，净电荷为零并不意味着表面每个位置都不带电，也不意味着分子间相互作用全部消失。不同区域仍可能带有相反电荷，疏水接触与氢键也仍然存在。等电点附近容易沉淀是一种常见趋势，实际溶解度和沉淀后的可逆性需要结合具体分子理解，不能把沉淀自动看成保留天然活性的证据。

用大小作区分：膜与多孔小球做的事情不同

把盐水和蛋白质装进合适的透析膜，再放入较大体积的外部液体，小分子可以穿过膜，蛋白质则主要留在样品一侧。小分子的随机运动不断发生，当膜两侧可自由通过的组分浓度不同时，就出现从高浓度一侧到低浓度一侧的净转移。达到平衡后，分子仍然来回移动，只是两个方向的平均交换抵消。透析因此能够换去一部分小分子环境，而不必把蛋白质沉淀下来。膜的截留规格描述对一定测试对象的保留能力，实际能否通过还与形状、相互作用和时间有关，并不是一把绝对锋利的分子量剪刀。

读这个计算时，可以先把浓度理解为“每单位体积装了多少溶质”。若用物质的量计数，一摩尔包含约6.022×10²³个指定粒子，mol/L就是每升液体中的摩尔数；一微摩尔是百万分之一摩尔。浓度乘体积得到总量，但计算时两者的体积单位要配合。透析平衡前后，小分子从较小的空间分散到较大的空间，总量保持而浓度下降。由于本式只使用两个体积的比值，只要样品与外液都使用同一种体积单位，就可以直接比较，不必为了计算比例把毫升各自换成升。

上面的物料衡算也解释了为什么换外液有效。第一次达到平衡后，旧的小分子已经分布到样品与外液的总体积中；倒掉外液，就带走了其中大部分，再加入不含该组分的新外液，又建立新的浓度差。与一次使用相同总量的外液相比，分次更换常能得到更低的残余比例。这里假定样品体积保持稳定，小分子不与蛋白质紧密结合；如果它大量结合在蛋白质上，或者形成不能通过膜的聚集体，实际行为就要把这些状态一并考虑。

超滤同样使用膜，但增加压力差或离心产生的推动，使溶剂与可通过的组分流向另一侧。保留下来的蛋白质可以被浓缩，继续补入新缓冲液并移去滤出液则有助于换液。膜附近的蛋白质浓度可能高于液体主体，吸附和聚集也会影响回收，所以“体积缩小了多少”与“目标保留了多少”要分别测量。透析主要依靠扩散趋向平衡，超滤则利用跨膜流动完成浓缩或换液；它们都能处理大小差别，却并不是同一种操作的两个名字。

尺寸排阻色谱把多孔小球装在柱中，流动液体经过小球之间的空隙。较大的分子难以进入孔道，可访问的液体体积较少，因此较早随流出液离开；较小的分子能进入更多孔隙，平均停留得更久，较晚流出。这里的大小是分子在溶液中的有效尺寸，包含形状和水化等因素。同样质量的细长分子与紧凑球状分子，可能表现出不同的流出位置。可以用走过一条带有许多侧巷的街道来理解：能够进入侧巷的行人可访问的空间更多，离开整条街所需的平均时间也会改变。

这种方法适合把蛋白质与小分子盐分开，也可以在合适孔径范围内区分单体、较大组装体和聚集物。若两个组分都完全进不了孔，它们都在早期流出，柱子便难以按大小继续区分它们；若都能访问几乎全部孔体积，也会出现类似问题。利用标准蛋白把流出位置换成表观分子量时，还要考虑标准品与目标的形状是否相近。柱子测到的是分离行为，通过标定才得到质量估计，这与直接测定单个分子的质量属于不同层次的信息。

用电荷作区分：让分子选择表面或方向

蛋白质有许多能够接受或失去质子的基团，它们在某一pH下共同决定平均净电荷。低于某个蛋白质的等电点时，它通常偏正电；高于等电点时，通常偏负电。离子交换色谱利用带有固定电荷的表面与这些分子相互作用。正电的阴离子交换介质结合带负电的组分，负电的阳离子交换介质结合带正电的组分；名称来自被交换的离子，而不是介质自己的电荷。把这一点弄清，比记“正柱”或“负柱”更不容易出错。

被保留的分子可以通过改变盐浓度或pH逐步洗脱。盐离子能够屏蔽和竞争带电相互作用，使结合较弱的组分先离开，结合较强的组分在另一条件下离开；改变pH则会改变蛋白质与某些介质基团的电荷状态。实际结合还受表面电荷的局部分布影响，因此净电荷相似的两种蛋白质也可能有不同的保留行为。离子交换的设计需要同时考虑目标是否稳定、上样环境是否适合结合，以及洗脱后的盐和pH是否适合下一步，而不只是挑选一个离等电点很远的数值。

把电荷差别转变成运动差别，就得到电泳。在外加电场中，带电分子受到电力，同时在液体和凝胶中受到阻力。Arne Tiselius关于电泳的研究让看似均一的蛋白质溶液显露出不同组分的运动边界，帮助人们理解血清并非一种单一蛋白质。这个历史问题仍然直接对应今天的测量：如果两类分子在同一电场中移动速度不同，它们就可能在空间上逐渐分开。测到的差别既与电荷有关，也与分子的大小、形状及所处介质有关。

等电聚焦进一步让电泳环境沿位置改变pH。一个分子如果位于比自身等电点更酸的一侧，通常带正电，受电场作用向较碱的一侧移动；越过自己的等电点后，它转为负电，迁移方向又会指向较酸的一侧。两个方向都把它带回同一附近位置，所以扩散出去的分子受到恢复作用，形成较窄的带。可以把它理解为一条两侧都会把球推回中间的浅谷，只是这里的恢复机制来自电荷随pH改变，而不是重力。最终带宽仍由扩散、梯度和分离条件决定。

等电点也不是只由氨基酸组成决定、在所有条件下完全不变的标签。末端形式、磷酸化或糖基化等修饰、基团所处微环境以及溶液条件，都可能影响电离与测量得到的等电行为。同一种蛋白质出现相近的几个聚焦带，可能提示不同修饰状态，接下来需要用其他分析确认。将电荷信息与大小信息配合，例如先等电聚焦再按另一机制分离，可以把原先重叠的组分展开成更丰富的图谱。

利用识别来捕获：亲和力也需要材料配合

大小和电荷是许多分子共有的性质，亲和分离则利用更有针对性的相互作用。若一种蛋白质能够结合某个配体，可以把配体固定在多孔载体上，让目标经过时被保留，再改变条件使它释放。配体是参与结合的分子或基团，可以是抑制剂、抗体、糖结构，也可以是能与特定蛋白区域相互作用的人工化学结构。捕获过程像为特定物品设置合适的挂钩，但真实的结合依赖许多原子之间的相互作用，而不只是形状恰好吻合。

Pedro Cuatrecasas、Meir Wilchek和Christian Anfinsen在1968年关于亲和层析的工作展示了如何把生物识别关系变成分离工具。原本用于理解酶与配体关系的信息，也可以用于从混合物中抓住酶。这个思路把“知道一种分子能做什么”转化成了“借助这种能力把它分出来”。固定配体之后，目标既要接近结合位置，又要在需要时离开，因此结合过弱、释放困难或非特异吸附过多，都可能降低整个方法的实用性。

载体通常需要具备合适的孔结构、液体通道、化学稳定性与较低的非特异吸附。亲水性多糖材料、改性的纤维素以及合成聚合物，都可以承担这些任务；它们可以做成小球、平板膜或中空纤维等形式。多孔小球提供内部表面积，但目标进入内部需要时间；流通孔道中的亲和膜可以让流动把分子带到位点附近。载体的选择因而连接了分子识别与材料加工：即使配体在自由溶液中能够很好地结合，固定在不合适的表面后也可能难以接近或失去有利取向。

间隔臂把配体与载体表面适当隔开，有时能减小位阻，让大分子更容易接触结合位置。它的长度、柔性与自身吸附倾向需要配合目标设计，并不是越长越好；配体密度也不是越高越好，过于拥挤可能降低可访问性，并改变多点结合与释放行为。把配体接到表面可以利用羧基、氨基或其他可反应基团的化学连接。这里既要考虑连接是否稳定，也要考虑是否误占了配体本来用于识别目标的位置。材料表面“接上了多少”与“真正可用的位点有多少”，属于两个需要分别认识的量。

固定化金属离子亲和分离利用螯合基团把金属离子固定，再由金属的其他配位位置与蛋白质上的合适基团作用。组氨酸侧链的咪唑基团常参与这类结合，因此富含可接近组氨酸的标签可以帮助捕获。金属种类、螯合结构、pH与竞争配体共同决定选择性；螯合剂若把金属夺走，原来的固定结构也可能改变。还有利用疏水相互作用、羟基磷灰石表面多种相互作用或亲硫配体的分离方式，它们需要按各自机制选择盐和洗脱条件。区分机制的价值在于：同样是改变盐浓度，不同介质中的结合趋势可能相反。

从曲线决定收集哪一管：纯度与回收率的关系

流出柱子的液体可以按体积分成一管一管的小份，称为馏分。同时，检测器连续记录某种信号，就得到随时间或流出体积变化的色谱图。图上的一个峰表示某段液体中的检测响应较强，它可能主要对应一种组分，也可能包含几种重叠的组分。峰高受浓度与峰宽影响，峰面积在适合的响应条件下与通过检测器的量联系起来。理解这层关系后，就能把曲线与实际收集管对应起来，而不是把图上的每一个凸起直接当成已经鉴定好的纯蛋白质。

紫外吸收是常用检测方式。光通过样品后，某些波长的强度下降，仪器把这种变化转换成吸光度。蛋白质在280 nm附近的响应与色氨酸、酪氨酸及二硫键等结构有关，不同蛋白质每单位量的响应可以不同。核酸、某些小分子和散射也可能影响读数。一个检测波长因而提供特定的观察窗口；它看得见什么、对什么反应较弱，需要与目标和可能存在的其他组分联系起来。用标准品或已知响应建立定量关系，比只按峰形判断含量更清楚。

收集范围通常需要在纯度和回收率之间作选择。若只取目标峰最集中的几管，可能减少相邻杂质，却也放弃目标峰两侧的一部分分子；若收集范围很宽，就能保留更多目标，但可能把邻近杂质一起收入。一个有意义的决策，是用同一套目标与杂质的量来比较不同范围，而不是把“峰顶最漂亮”当成唯一标准。下面的交互使用一组设定的馏分含量，调节起止管号即可看到收集范围、目标回收与纯度一起改变。

如果目标和杂质的峰重叠严重，继续缩窄收集范围可能损失很多目标，却仍然难以达到需要的纯度。这时可以换用另一种分离性质，或改变样品负载、介质和条件来改善分离。反过来，已经满足目标实验的样品继续增加步骤，也可能增加时间、稀释和损失。纯化路线的安排需要考虑每一步带来的实际收益：去掉哪类混杂、保留多少目标、是否改变组装状态，以及下一步还需要什么环境。

当记录中出现活性回收率超过100%时，也值得从测量机制理解。初始混合物可能含有抑制剂，分离后抑制减少，同样数量的酶表现出更高的测得活性；也可能出现测定条件或取样误差。此时总活性不能直接当作不变的目标分子数量。把活性、目标质量与抑制条件分别检查，能够识别分离究竟改变了样品组成还是功能表达。这样的解释让异常数字成为进一步了解体系的线索，而不是简单把它删去或宣称产率超过了物料上限。

一条带告诉了什么：凝胶、电泳与免疫印迹

聚丙烯酰胺凝胶可以看成充满水的交联聚合物网络，蛋白质在电场推动下穿过网络时，会受到与尺寸和形状有关的阻碍。在非变性电泳中，原有电荷、形状和亚基组织共同影响迁移，因此它适合观察某些复合物或构象差别。采用较温和条件可以帮助保留原有组织，但是否保持活性仍由具体蛋白质和电泳环境决定。一条带移动得更远，可能因为电荷更适合这个方向，也可能因为有效尺寸更小，不能只凭距离直接推出分子质量。

SDS是一种带负电的表面活性剂，它与许多蛋白质结合并促使其展开，使不同链的电荷与质量之间趋向可比较的关系。再配合合适的还原处理，可以把二硫键连接的链分开。这样，在所选凝胶体系的有效分离范围内，迁移位置主要反映多肽链的表观大小。Ulrich Laemmli在1970年研究噬菌体T4结构蛋白加工时使用的体系成为后来广泛采用的电泳方法。这里的方法发展与生物学问题直接相连：要理解装配过程中哪些蛋白链发生了变化，就需要把它们在混合物中分开并比较。

用已知质量的标记蛋白建立标尺，就能把未知条带的位置换成表观分子质量。常用的标定关系涉及质量的对数，因为相同的迁移距离变化往往对应质量按倍数变化，而不是每次减少相同的质量。读图时先找到标记与未知带所处的有效范围，再做插值，能减少把不适合范围的经验关系硬套到所有蛋白质上的问题。糖基化、异常SDS结合和未充分解离等情况会改变迁移表现，因此表观质量应与序列、完整分子或其他测量一起解释。

免疫印迹把“按迁移位置分开”与“用抗体识别”接起来。Harry Towbin、Theophil Staehelin和Julian Gordon在1979年报道的电转移方法使凝胶中的蛋白图样能够转移到膜上，再利用抗体等分子检测相应位置。膜提供便于接触的表面，封闭处理减少其他位置的非特异结合，一抗识别目标表位，带有检测标记的体系产生可见信号。这里保留的是分离图样与可识别信息，经过SDS处理的蛋白质并不因此恢复原有的天然活性。

一条染色带说明在该方法的分辨能力和检测灵敏度下，某个迁移区域占主要响应；一条免疫信号带则说明抗体在该区域识别到了某种结构。若两种蛋白质移动得接近，它们可能重叠；若目标的一部分发生切割但仍保留表位，也可能继续被抗体识别。合适的标记、对照、曝光范围与其他身份信息能帮助解释这些结果。将这些测量看成相互补充的观察窗口，就能理解为何纯度、身份、完整性和活性需要分别回答。

把分子变成可称量的离子，再把证据接回样品

质谱通过研究带电粒子的运动来获得质量相关信息。一个困难是，蛋白质这样的大分子既不容易挥发，又可能在剧烈加热或电离时分解。电喷雾和基质辅助激光解吸电离提供了较温和地生成大分子离子的途径。John Fenn与同事在1989年关于大分子电喷雾的研究展示了多电荷离子序列如何让较大的生物分子进入可分析的质荷比范围。历史上的障碍不只是天平不够精细，而是怎样把待测对象以可解释的离子形式送到测量过程。

电喷雾把溶液形成带电小液滴，随着溶剂去除和液滴演变，产生气相离子。一个蛋白质可以携带不同数目的电荷，因此同一种中性分子可能对应一组质荷比峰。质量分析器直接区分的是离子质量与电荷数的比值，推回中性分子质量需要识别电荷状态及所加的离子种类。对于只加入质子的简单正离子系列，可以使用下面的关系；盐加合物、不同修饰或碎片则会让峰的解释更丰富。

基质辅助激光解吸电离把待测物与能够吸收激光能量的基质放在一起，使一部分待测分子进入气相并形成离子，常见谱图中单电荷离子较突出。飞行时间分析器则利用经过加速后不同质荷比的离子到达检测器所需时间不同进行区分。仪器的离子形成效率、传输、分辨率与检测响应共同影响能够测到的对象，所以不能只把飞行管加长理解为可以无限测量任意质量。对于聚氨基酸等链长有分布的样品，相邻峰的质量间隔还可能反映重复单元，端基和加合离子则帮助解释整组峰的位置。

完整分子的质量可以检查大范围身份与修饰，碎片信息可以进一步帮助定位序列或连接。它们与尺寸排阻和凝胶结果结合时，能回答更多结构问题。假设一种样品在保持组装的溶液条件下表现为较大颗粒，而在还原SDS电泳中主要出现较小的单链带，这会提示多链组织值得进一步考察；再结合合适的质量、浓度依赖和组装测量，才能把亚基数与状态说清楚。色谱和电泳中的表观大小不是同一个物理量，把它们看成独立信息比直接相除更有意义。

结晶同样提供一种有序排列的状态，并能够支持结构测量，但是否形成晶体由分子间接触、浓度和环境共同决定。晶体的出现既不自动量化样品纯度，也不直接等于功能已经得到保存。面对任何一个最终样品，可以沿着同一条线索整理证据：它的化学身份是什么，混合了哪些其他组分，以什么组装状态存在，在指定条件下是否完成目标功能。分离把复杂混合物变成可研究的样品，鉴定则把一管看不见内部差别的液体变成结构与数量都能清楚描述的对象。