一块豆腐、一根头发与一个共同的问题
豆浆加热后加入合适的凝固剂，可以变成能用筷子夹起的豆腐；头发遇水会改变手感，却不会像糖一样迅速溶解；鸡蛋清受热后由透明变成白色，也很难再恢复原来的流动状态。这些现象都与蛋白质有关，但“里面含有蛋白质”还不足以解释它们。真正需要追问的是：蛋白质由什么小单元连接而成，连接的顺序是什么，链在水中怎样折叠，以及许多条链相遇后怎样组织。本章沿着这些问题，从能看见的材料变化走到看不见的分子结构。掌握这条路线后，再遇到“蛋白质变性”“二级结构增加”或“形成了蛋白质网络”等表述，就能知道它们分别改变了哪个层次。
先把“分子”想成一组由化学键连接起来的原子。原子之间形成共价键时共享电子，连接通常比分子之间的许多弱相互作用更难改变；把一条蛋白质链剪成短肽，就需要改变其中某些共价连接。蛋白质是生物大分子的一类，另一些常见成员包括由糖单元连接的多糖，以及由核苷酸连接的DNA和RNA。它们都可以很长，却使用不同的单元与连接方式。这里的“大”是分子层次的大小：一条数纳米尺度的蛋白质分子，用眼睛看不见，但相对于水分子已经包含许多原子。纳米是十亿分之一米，正好让我们用较简洁的数字描述许多分子结构。
“生物大分子”和“生物材料”回答的不是同一个问题。前者强调分子的种类与生命化学背景，后者通常涉及材料与生物系统的作用或用途。一种蛋白质可以是细胞里的酶，也可以经过组装成为薄膜、纤维或水凝胶；人工合成的聚合物也能被设计成与生物系统接触的材料。因此，从蛋白质走向材料研究，需要同时认识分子本身和分子形成的集合体。豆腐的硬度主要来自许多蛋白质分子形成的网络，单独一条链的形状、网络中连接的密度和留在孔隙里的水，都能影响最终的触感。
蛋白质也可以按外形、组成或功能来分类，但这些分类最好看作不同的观察窗口。肌红蛋白整体较紧凑，胶原蛋白以细长的结构承担支撑任务；某些蛋白质还结合金属离子、糖链或其他非蛋白组分，血红蛋白中的血红素就是重要例子。外形紧凑并不自动保证容易溶于水，细长也不自动意味着不溶，因为表面化学、溶液环境和分子间相互作用同样重要。后面我们会把这些差异落实到氨基酸侧链、骨架转动和分子组装上，使分类成为理解机制的起点，而不只是一张需要记住的名单。
氨基酸怎样成为带有方向的链
构成普通蛋白质的α-氨基酸有一个共同骨架：中心的α碳连接氨基、羧基、一个氢原子和一个侧链。侧链常用字母R表示，这里的R只是“此处可以换成不同基团”的位置标记。甘氨酸的侧链是氢，丙氨酸的侧链是甲基，而赖氨酸的侧链末端带有可以接受质子的氨基。可以把共同骨架比作同一种插头接口，把侧链比作接在接口上的不同部件；相同接口使单元能连续连接，不同部件则改变局部的体积、亲水性、电荷和反应能力。
这些连接还具有三维方向。α碳的四个连接大致指向四面体的四个角；当它连着四种不同的基团时，便可以有两种互为镜像、却怎样整体转动都不能重合的安排，像左手和右手一样。这种性质叫手性，两种安排称为一对对映体。普通蛋白质中的大多数这类残基采用L构型；L和D是按照历史上选定的参照结构区分空间安排的名称，参照物是甘油醛这种小分子，并不是说整条链向左或向右盘旋，也不能仅凭L字母判断它使偏振光转向哪边。甘氨酸的α碳连着两个相同的氢，失去了“四种不同基团”这一条件，因此这个碳不是手性中心，没有对应的L/D对映体。认识这一点，才能理解为何换成相反构型的氨基酸，即使原子种类和质量不变，也可能改变分子识别或局部折叠。
化学结构图里常写的氨基和羧基，并不是在任何水溶液中都保持同一种带电状态。质子可以在基团与水环境之间交换，pH用来表示这种环境的酸碱性质；pH降低通常意味着环境中氢离子的活度提高。常见中性条件下，游离氨基酸的α氨基多呈带正电形式，α羧基多呈带负电形式，所以一个分子可以同时带有正、负电荷。总电荷为零也不等于每个位置都不带电。就像一栋楼里收支相抵仍有多笔收入和支出，分子局部的电荷分布仍会影响它与水、离子和其他分子的接触。
两种氨基酸通过肽键连接时，一个单元的羧基部分与另一个单元的氨基部分形成酰胺连接。用游离氨基酸作反应物进行原子收支统计，每形成一个这样的连接，产物比两种反应物的总和少一分子水的组成。因此，连接到链中的单元叫作“氨基酸残基”：它已经不是反应前完整的游离氨基酸。细胞合成蛋白质时使用核糖体、转运RNA和活化的底物，实际反应路径并不是把一杯游离氨基酸加热脱水；这里的脱水计数用于理解连接前后的组成，说明为什么不能把游离单体的摩尔质量直接相加就当作多肽的摩尔质量。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| Mchain | 线性肽链的摩尔质量 | g mol⁻¹ |
| N | 链中氨基酸残基的数量 | 1 |
| i | 从1到N逐个计数的残基编号 | 1 |
| Mi | 第i个位置对应游离氨基酸的摩尔质量 | g mol⁻¹ |
| MH₂O | 水的摩尔质量，约18.015 | g mol⁻¹ |
| Σ | 把所有位置对应的摩尔质量依次相加 | — |
怎样理解把N个单元连成一条未闭合的链需要N−1个连接，所以从游离氨基酸的总组成中减去N−1份水的组成。摩尔是计量大量粒子的单位，一摩尔包含6.02214076×10²³个指定粒子；g mol⁻¹表示每摩尔的质量。
算一个例子甘氨酸约75.07 g mol⁻¹，丙氨酸约89.09 g mol⁻¹。二肽有一个肽键，摩尔质量约为75.07+89.09−18.015=146.145 g mol⁻¹。交换两者的顺序保持这一质量，却改变序列。
使用条件这里计算端基未修饰的线性肽链。环化、端基封闭、二硫键或其他修饰要另外计入原子组成变化；细胞合成的具体反应步骤与这项组成收支分别描述。
一条没有闭合成环、端基也没有另外封闭的肽链，通常保留一个氨基端和一个羧基端，分别叫N端和C端。书写序列时约定从N端写到C端。于是，甘氨酸接丙氨酸与丙氨酸接甘氨酸，虽然含有相同数量的两类残基，总质量也相同，连接方向和端部邻居却不同。序列可以用三字母缩写Gly、Ala，也可以用单字母G、A表示。单字母表示法适合写长链，但字母只是残基身份的编码，并不直接表示它的形状或电荷；要解释性质，还需要把字母还原为对应侧链的化学特点。
理解侧链时，可以先掌握几种具体作用。带有较多非极性碳氢部分的侧链，放到水中常使周围水分子的排列受到影响；带电侧链会与反号电荷相互吸引，也会被溶液中的其他离子屏蔽；羟基和酰胺基团能够参与氢键；半胱氨酸的两个巯基在适当氧化条件下可以形成二硫键。甘氨酸较小，能进入某些其他残基难以采用的骨架角度；脯氨酸的侧链回接到骨架氮上，限制了转动，同时改变该位置作为氢键供体的能力。分类的价值在于帮助预测局部接触，而不是把某种残基永远贴上“稳定螺旋”或“破坏结构”的标签。
同一种基团的电荷也可能随环境改变。为了看懂这种变化，可以先研究一个独立的酸性位点：它在保留质子和失去质子两种形式之间交换。pKₐ表示这两种形式在相应近似条件下数量相当的酸碱位置，pH与pKₐ的差则告诉我们哪一种形式占优势。下面用一个位点的模型把“偏酸”“偏碱”变成比例；当许多位点彼此影响，或某个基团埋在蛋白质内部时，还要重新考虑它的实际pKₐ。这样的环境依赖，正是同样的氨基酸在不同蛋白质里可能表现不同的原因之一。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| θ | 处于去质子化形式的比例，取值0到1 | 1 |
| pH | 描述溶液氢离子活度的酸碱指标 | 1 |
| pKₐ | 该酸性位点解离常数的负常用对数 | 1 |
| 10ˣ | 以10为底的指数，x每增加1数值扩大10倍 | 1 |
怎样理解一个独立位点在质子化和去质子化两种形式之间交换，两种比例相加为1。酸碱平衡给出两种形式的比，再用这个总数归一化，就得到θ。pH与pKₐ相等时，分母是2，两个状态各占一半。
算一个例子设pKₐ=4.0。当pH=5.0时，θ=1/(1+0.1)≈0.909，即约90.9%的位点失去质子；在pH=3.0时，θ=1/(1+10)≈0.091，即约9.1%。
使用条件采用一个独立酸性位点和相应稀溶液近似，温度固定。蛋白质中的局部环境及位点间相互作用可改变实际pKₐ。
为什么必须知道顺序：从胰岛素到片段拼接
假设把两条短肽都完全拆成游离氨基酸，测得每条都含四个赖氨酸和四个亮氨酸。这样的组成分析告诉我们“有哪些单元”和“各有多少”，却没有告诉我们“谁挨着谁”。一种序列可以把赖氨酸集中在前半段、亮氨酸集中在后半段，另一种则让两类残基交替出现。两条链的总组成相同，局部电荷和非极性部分的分布却不同，可能形成不同的分子内接触或分子间组织。这个区别类似相同的字可以排成不同的句子，但化学序列的影响还受到空间转动、溶剂和温度控制，不能只凭字母排列就画出唯一的三维结构。
20世纪中叶，蛋白质究竟具有确定的残基顺序，还是主要由相近组成的分子混合而成，是可以用实验回答的重要问题。Frederick Sanger对胰岛素的研究把这个问题推进到具体的化学连接：先识别链端，再把长链切成能够分析的片段，最后利用不同切割方式产生的重叠信息恢复顺序。胰岛素由两条肽链和特定的二硫键连接组成，因此仅仅知道每条链的残基序列还不够，还要找出哪些半胱氨酸彼此连接。这个研究路线把“蛋白质是一团复杂物质”转变为“蛋白质可以用明确的序列和连接关系描述”。
片段拼接的思路可以用一条短链演示。若一个处理方法得到AGK片段，另一个得到GKVE片段，共同的GK为两者的相对位置提供线索，可以拼成AGKVE。真实测序中会遇到重复片段、未完全切开的连接、化学修饰以及不同片段共存，所以研究者要使用多种相互补充的证据。关键不是“把片段按长度排好”，而是找出能同时满足端部身份、片段组成和重叠顺序的整体解释。测出二硫键时还需保留或有控制地改变这种连接，否则肽链顺序虽已确定，链之间怎样相连仍可能不清楚。
序列空间为什么很快变得庞大，也可以通过简单计数理解。如果每个位置可以从20种常见残基中任选一种，增加一个位置，就把已有的每一种序列再分成20种可能。这是乘法原理：前一个位置的选择与后一个位置的选择组合起来，总数相乘。计数并没有说这些序列都能被细胞制造、都能稳定折叠或都具有某种功能，它只是说明“长度相同”包含了多大的化学差异。研究蛋白质时，链长、组成、顺序和化学修饰因此必须分开描述。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| Ω | 可选序列的总数 | 1 |
| q | 每个位置允许选择的残基种类数 | 1 |
| N | 序列中的位置数 | 1 |
| qᴺ | N个q相乘，表示逐个位置组合选择 | 1 |
怎样理解第一个位置有q种选择；对其中每一种，第二个位置仍有q种，因而两个位置有q×q种。把相同的组合推理推进到N个位置，就得到指数。这里数的是有方向的序列。
算一个例子用20种常见残基组成长度为5的序列，有20⁵=3,200,000种形式上的选择。若只允许G和A两种残基，长度为5时有2⁵=32种。
使用条件各位置独立选择，允许重复使用残基；没有固定总组成或功能条件。固定每种残基数量时，需要使用另一种计数方法。
相同组成，不同邻居
切换排列，观察组成不变时邻居关系怎样改变。
序列中的一个位置发生变化，影响大小取决于它在结构和功能中的位置。若变化发生在酶的催化部位，可能改变反应步骤；若把埋在内部的小残基换成体积很大的残基，可能改变局部堆积；若发生在较灵活、远离关键接触的区域，影响又可能较小。解释变化时，可以沿着“侧链化学改变了什么—哪些接触随之改变—哪种可测量性质受影响”的路径思考。这比把所有突变都理解成“蛋白质坏了”更接近实际，也能帮助我们区分分子结构变化与整块材料性能变化之间还隔着哪些组织层次。
链能转动，却不能任意穿过自己
把蛋白质画成一串圆珠很适合数残基，却容易让人以为每个连接都像松散绳结一样自由转动。肽键附近的电子分布使酰胺连接具有部分双键性质，相关原子倾向于接近平面排列，绕肽键的转动受到较大限制。相邻的肽平面主要通过α碳附近的两种骨架转角改变相对方向：φ描述绕N—Cα键的转动，ψ描述绕Cα—C′键的转动，其中C′是羰基碳。肽键本身的转角常记作ω。把这几个名字和对应的化学键对上，比单独记住一串角度更重要，因为真正决定链怎样弯曲的是哪些连接可以转、转动后原子会到哪里。
二面角可以借助两块相邻的硬纸片理解：两块纸片沿一条公共边连接，绕这条边合拢或打开时，它们之间的角度发生变化。分子里由四个连续原子定义两个平面，两个平面的夹角就是相应的二面角。角度通常用度表示，绕一整圈是360°；采用从−180°到180°的表示，只是把同一圈从一个指定位置切开。于是，179°与−179°在空间上其实很接近，不能把它们看成隔得特别远的两种状态。理解这个周期性，对阅读蛋白质骨架角度图很有帮助。
即使某根单键原则上能够转动，相邻原子的体积也会限制可用角度。两个原子靠得过近时，能量会迅速升高，链不能像没有厚度的线条那样互相穿过。把φ和ψ分别放在横轴、纵轴上，就可以检查哪些组合比较容易出现，哪些会引起明显的空间冲突。这就是Ramachandran图背后的几何思想。它把许多看似复杂的三维排斥问题放到一张二维地图里：不同的局部结构占据不同区域，甘氨酸与脯氨酸因侧链几何特殊，允许区域也不同。图上的区域描述局部骨架构象，并不直接等于整条蛋白质的功能分类。
肽键通常采用反式构型，但“通常”并不意味着每一处都完全相同。连接到脯氨酸的肽键具有值得单独考虑的顺反分布，顺反转换还可能影响折叠速度。另一方面，蛋白质内部的柔性并不只来自主链；侧链本身也有可转动的键，较长的侧链能够尝试多种朝向。想象一把折叠扇：扇骨限制主要运动，扇面上的小装饰仍可另外摆动。蛋白质的运动同样同时包含主链与侧链的变化，某张结构图只是对这些运动在特定条件下的一种描述。
螺旋和折叠片怎样从局部连接中出现
如果相邻残基反复采用相近的骨架转角，整条链就会形成有规律的局部形状。α螺旋是一种常见例子：肽骨架绕着一条轴线盘旋，许多羰基和酰胺氢沿着螺旋方向形成氢键。氢键可以先理解为带有适当电性与几何关系的供体和受体之间的定向吸引；它通常弱于骨架共价键，但许多氢键按合适方式排列后，会共同影响结构的稳定性。标准α螺旋中，第i个残基的羰基可与第i+4个残基的骨架N—H形成氢键。这里i只是沿链编号，i+4表示向后数四个残基，不是另一个化学种类。
1951年，Linus Pauling、Robert Corey与Herman Branson提出满足肽平面、键长、键角与氢键要求的螺旋结构。这段历史帮助我们理解结构模型怎样建立：先尊重小分子化学已经测得的局部几何，再寻找能够连续重复而不发生严重冲突的排列。今天常用的α螺旋几何描述是每圈约3.6个残基，相邻残基沿螺旋轴的前进量约0.15 nm。每圈不必是整数个残基，因为“走完一个残基”和“绕轴转完一圈”是两种不同的周期；这与楼梯的台阶数可以和观察方向产生不同的重复节奏相似。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| Lα | 首尾残基Cα位置沿螺旋轴方向的间距 | nm |
| N | 这一段规则α螺旋中的残基数 | 1 |
| h | 相邻残基沿轴的前进量，约0.15 nm | nm |
怎样理解N个残基位置之间只有N−1个相邻间隔，每个间隔沿轴前进h。这里测的是轴向投影；沿着盘旋的骨架逐键走的路程更长，不能与轴长混用。
算一个例子12个残基之间有11个轴向间隔，得到Lα≈11×0.15=1.65 nm。增加一个保持规则螺旋构象的残基，轴向间距约增加0.15 nm。
使用条件使用理想化规则α螺旋的平均几何；实际蛋白质中弯曲、末端和局部角度变化会改变长度。
β折叠片采用另一种组织方式。每段链先形成较伸展、略呈锯齿的β链，邻近β链之间再以氢键连接成片层。图上用箭头表示β链时，箭头通常指向序列的N端到C端方向；相邻箭头同向称为平行，反向称为反平行。一个折叠片可以包含混合的方向，也可能由同一条多肽链折回来形成，或由不同链共同组成。锯齿骨架使侧链大致交替朝向片层两面，因此序列中侧链的排列能够改变两面的化学特征。这提供了一条从一级结构走向局部表面性质的具体联系。
螺旋和折叠片之间还需要转弯与连接区域。β转角常用四个连续残基描述，有些构型能通过第一个残基的羰基与第四个残基的N—H形成氢键；较长、不形成规则螺旋或片层的区域通常称为环区。这里的“环”主要描述链折返的形状，并不一定意味着化学骨架闭合成环。转角和环区让不同结构单元接到一起，还常位于结合位点或参与开合运动。它们可能比较灵活，也可能因周围接触而具有清楚的构象，所以不能把“非规则二级结构”直接等同于“没有结构”或“没有功能”。
二级结构说的是局部骨架与氢键的组织方式，而不是给整条蛋白质贴一个唯一标签。一种蛋白质可以同时含有α螺旋、β折叠片、转角和较灵活的片段。同样的局部螺旋也能出现在承担完全不同任务的蛋白质中。把局部结构看作搭建空间形状的零件，有助于继续讨论三级结构；但这些“零件”由同一条化学链连续连接，彼此的长度、顺序和方向受到整体约束，并不像桌面上可以随意搬动的独立积木。
从局部结构到完整分子：水、接触与自由能
一条蛋白质链在三维空间中的整体排列通常称为三级结构，包括相距很远的序列片段怎样靠近、哪些侧链埋在内部、哪些表面朝向溶液，以及不同局部结构怎样相互定位。这个概念既可以用于较紧凑的蛋白质，也可以用于具有细长结构或多个结构域的链。结构域是链中能够形成相对完整结构单元的一部分，可以与其他部分通过较灵活的连接区相接。由几条多肽链组成的复合体，还需要描述亚基之间的位置和接触，这属于四级结构；亚基之间可能以非共价作用结合，也可能另外有共价交联。
水在折叠过程中不是一个被动背景。把非极性侧链暴露在水中，与把它们聚在一起，会改变周围水分子的排列以及整个体系的自由能，这与常说的疏水效应有关。疏水效应不是一种可以像肽键那样画成固定连线的“疏水键”。蛋白质内部还要同时考虑氢键、带电基团之间的相互作用、近距离堆积以及范德华作用。某一个接触是否有利，要与它取代了哪些蛋白质—水、水—水或其他接触一并比较。例如，一个基团在折叠前已能与水形成氢键，折叠后形成内部氢键的收益，就不能只数新增了几根连线。
链折叠时通常失去部分可采用的构象，同时改变分子接触与溶剂状态。为了把这些变化放在同一把尺子上，热力学使用自由能。焓可帮助描述体系能量和与外界压力体积交换有关的贡献，熵则与可实现状态的数目及其分布有关；温度决定熵项在自由能中的权重。真正比较折叠与展开时，必须把蛋白质和受影响的溶剂一起考虑。这样才能解释为什么“形成更多接触”与“有更多可选形状”之间会发生竞争，以及为什么改变温度、盐浓度或溶剂，会改变哪一类构象更常出现。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| Δ | 折叠态的量减去展开态对应的量 | — |
| G | 吉布斯自由能，按每摩尔蛋白质表示 | J mol⁻¹ |
| H | 焓，包含相应体系的能量贡献 | J mol⁻¹ |
| S | 熵，包含蛋白质及受影响溶剂的贡献 | J mol⁻¹ K⁻¹ |
| T | 绝对温度，摄氏温度加273.15 | K |
| fold | 表示这里比较的是折叠过程 | — |
怎样理解恒温恒压条件下用自由能比较状态。折叠改变分子接触，也改变蛋白质和溶剂可实现的状态；T把熵变化换算为与焓相同的能量单位。ΔGfold为负时，折叠态的自由能更低。
算一个例子设某一温度下ΔHfold=−30 kJ mol⁻¹，ΔSfold=−0.080 kJ mol⁻¹ K⁻¹，T=298 K。则ΔGfold=−30−298×(−0.080)=−6.16 kJ mol⁻¹。负号说明在这组条件下折叠态更有利。
使用条件比较相同温度、压力和组成条件下的状态。算例参数用于这一温度，随温度变化时需要同时考虑焓、熵和热容的变化。
自由能差还能与观测到的构象比例联系起来。先设想一种足够简单的蛋白质，在指定条件下可以近似分成折叠态和展开态两个状态群；每个状态群内部可以包含许多很相近的微观构象。平衡时，系统会偏向自由能较低的状态群，但热运动使另一类状态也可能出现。下面的指数关系给出这种二态近似中的比例，帮助我们把“比较稳定”转化为“在这些条件下更常被占据”。当蛋白质有多个重要中间态或发生聚集时，需要把那些状态也加入统计，不能继续用两个状态包办所有现象。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| pF | 平衡时处于折叠态群的分子比例 | 1 |
| ΔGfold | 折叠态减去展开态的摩尔自由能 | J mol⁻¹ |
| R | 摩尔气体常数，约8.314 | J mol⁻¹ K⁻¹ |
| T | 绝对温度 | K |
| exp(x) | 自然指数eˣ，e约为2.718 | 1 |
| F | 表示折叠态群 | — |
怎样理解平衡统计给出两类状态群的占据比，由自由能差相对于热能尺度RT的大小决定。两类比例加起来为1，归一化后得到上式。指数里的ΔGfold/(RT)没有单位，所以可以作为指数的自变量。
算一个例子取T=298 K，ΔGfold=−5.0 kJ mol⁻¹=−5000 J mol⁻¹。指数约为−2.02，得到pF≈0.883，即约88.3%。自由能相等时指数为0，两个状态群各占50%。
使用条件采用平衡二态模型，并把每类状态内部的构象贡献计入其自由能；这里没有描述折叠速度或分子间聚集。
从材料角度看，还要区分单条链内部的稳定与多条链之间的组织。某个蛋白质分子可以保持原来的折叠，却通过新的表面接触组装成网络；也可以先部分展开，暴露原先埋藏的基团，再与邻近分子形成新的连接。凝胶形成、纤维组装和溶液浑浊分别描述集合体层次的变化，它们与二级、三级结构有关，却不是同一个测量对象。因此，看到材料变硬时，合理的问题是哪些连接增加了、链的活动范围怎样改变、水怎样重新分布，而不是立即把原因归结为“蛋白质折得更好”。
展开之后能否回来：变性、复性与折叠环境
蛋白质变性通常指原有空间组织受到明显改变，并常伴随功能变化；这与把肽键逐一水解、直接剪断一级结构不同。加热、改变酸碱条件、改变溶剂或加入某些试剂，都可能改变支撑原有构象的相互作用。煮熟鸡蛋时，许多蛋白质展开并相互聚集，形成散射光的网络，所以蛋清变白并凝固。把它放凉并不会自动解除已经建立的分子间连接和空间阻碍。这个例子说明，恢复原来的温度只恢复了一个外部条件，未必恢复分子原先的接触关系和能够自由探索的路径。
Christian Anfinsen关于核糖核酸酶的实验提出了一个更精确的问题：若保留肽链序列，在适当条件下改变并重新恢复维持折叠的相互作用，活性结构能否重新形成？实验中通过变性条件和二硫键的还原使结构发生变化，再研究解除这些条件后活性怎样恢复。结果支持了序列与在指定环境下可达的活性构象之间的联系，也使折叠成为可以研究的物理化学过程。这里的重点是“序列加环境决定可用的相互作用与能量关系”，而不是把所有蛋白质都想成离开细胞也会立即、完全地自行复原。
复性要同时面对稳定性与到达路径两个问题。热力学上有利的状态，可以因为中途形成难以解开的接触、错误的二硫键或分子间聚集而难以迅速到达。细胞中分子伴侣等体系能够帮助某些蛋白质减少不合适的接触或经历必要的折叠步骤；有些蛋白质还需要其他亚基、辅因子、膜环境或化学修饰才能完成其功能。反过来，天然状态也不一定是一座几乎不动的紧凑结构：一些蛋白质或片段本来就保持较广的构象分布，这种灵活性能参与识别和调控。讨论“正确结构”时，应当把需要完成的功能和所在环境一起说清楚。
温度与蛋白质稳定性的关系也比“温度越低越稳定”复杂。升温会改变热运动和各种相互作用的贡献，某些条件下的降温也可能改变疏水效应与自由能平衡；不同蛋白质的具体响应需要结合测量来判断。盐对带电基团的作用同样有多条途径：它既能屏蔽静电，也可能影响溶剂环境和分子间接触。对初学者而言，最有用的习惯是把“蛋白质名称”和“溶液条件”作为一对信息来阅读。只记住一种蛋白质在某次实验中的折叠比例，尚不足以描述它在另一种温度、酸碱环境或浓度下的行为。
把结构层次用于解释一个真实现象
现在回到蛋白质材料。假设有两份相同浓度的蛋白质溶液，经过不同处理后，一份仍可流动，另一份形成了凝胶。首先需要区分溶液里分子的身份是否改变：是否发生断链、共价交联或化学修饰；其次再问局部螺旋、片层和整体折叠怎样变化；最后考察分子之间是否建立了贯通的连接网络。这些问题分别对应不同层次，因此通常需要互相补充的实验。测得某一类二级结构比例增加，有助于认识局部组织，但网络是否贯通还要结合更大尺度的结构与力学响应来判断。
不同测量可以想成从不同角度观察同一件折纸作品。质量与组成分析帮助辨认用了哪些“纸”和有多少，序列分析给出沿链的顺序，光谱可以对某些局部结构和环境变化敏感，散射与显微观察提供不同尺度的形态信息，力学测量则回答材料怎样传递和储存外力所做的功。没有必要在入门时记住每台仪器的操作细节，但应当养成“这个信号直接对什么敏感”的提问习惯。例如，一张结构示意图中的螺旋看起来更多，只有当它对应明确的结构测量与分析方法时，才成为关于样品的定量描述。
也可以用几道小问题检查自己是否把层次分清。两条链质量相同，能否说明它们序列相同？一条链保留了全部肽键，能否说明它仍保持原有功能？一个复合体分开成亚基，是否一定同时破坏每个亚基的二级结构？这些问题之所以值得思考，是因为它们分别把组成、连接、空间组织和组装状态拆开了。实际研究中，材料性能往往由几个层次共同决定；先分开定义，再建立它们之间的联系，才有可能解释哪一个处理步骤真正改变了最终行为。
展开思考：相同质量、相同链、相同结构分别说明什么？
相同质量可以对应不同的序列，甘氨酸—丙氨酸与丙氨酸—甘氨酸就是简单例子。保留肽键意味着主链连接可以仍在，但蛋白质可能已经展开、聚集或失去合适的结合位点。复合体解离描述亚基之间的关系改变，亚基本身可以暂时保留原有折叠，也可能随之变化，要根据它们的相互依赖程度判断。一个有条理的回答会先指出观察的是哪个层次，再说明还需要知道哪些结构或环境条件。
读到这里，蛋白质可以同时作为一条有方向的化学链、一组受到几何约束的可转动连接、一种在环境中不断运动的三维对象，以及材料网络中的一个组成单元来理解。序列决定了可发生哪些局部作用，环境改变这些作用的相对重要性，组装把单分子的行为连接到更大的尺度。以后学习多肽合成、蛋白质分离、酶催化或丝纤维时，都可以沿着这条路线追问：具体改变了什么连接、什么接触、什么状态，为什么会影响最终测得的性质。