一条分子怎样保存可以复制的信息
同一株植物可以不断长出具有相似形态的新叶，一团酵母可以在生长后产生更多酵母。细胞并不是把一整套已经完成的零件平均分下去，而是保留能够指导后续制造的信息，并在分裂时复制它。DNA之所以重要，正因为它把可长期保存的化学骨架与可变化的排列顺序放在了同一条分子上。RNA与它具有相近的化学构造，却承担了信息传递、分子识别、反应催化和调节等多种任务。理解核酸，可以把问题拆成三层：链怎样连接，顺序怎样被复制，细胞又怎样把顺序转化为实际工作。
一本书使用有限的字母排列出不同内容，DNA也用少数几种基本单元形成大量不同序列。不过分子并没有读懂文字的意识。所谓信息，是指一种排列能够通过具体化学过程影响后续产物的排列与作用。DNA上的一段序列可以决定某种RNA的顺序，RNA再通过细胞中的翻译系统影响蛋白质的氨基酸顺序。也有许多RNA本身就是功能产物，不需要被翻译成蛋白质。因而“遗传信息”既不是一团抽象的指令，也不是每一段DNA都直接对应一种蛋白质，而是能够沿着分子过程追踪的结构关系。
研究者怎样知道传递性状的物质是DNA？1944年Avery、MacLeod和McCarty的研究把能够改变细菌性状的活性物质与其化学组成联系起来。关键思路是分离候选物，观察改变是否能够传下去，并用针对不同分子的处理检查活性与哪一种成分相伴。这样的问题比“细胞里哪种物质最多”更有判别力。DNA当时只有少数几种已知碱基，看起来不如蛋白质多样；实验却提示，复杂性也可以来自长链上庞大的排列可能性。
1952年Hershey和Chase的噬菌体实验从另一方向追踪了遗传物质。他们分别利用磷和硫的同位素标记核酸与蛋白质，比较感染过程中标记进入细胞和留在外部的分布。同位素是同一种元素中质量不同的原子形式，能够在尽量保留化学性质的同时提供追踪信号。实验关注的是主要分布及其与后续繁殖的关系，而不是假设每一个标记原子都完成了绝对干净的分离。这种把分子身份与去向联系起来的方法，后来在复制、转录和蛋白质合成研究中不断出现。
细胞生物通常以DNA保存基因组，部分病毒则以RNA为遗传物质。DNA也并非只存在于细胞核：细菌没有由膜包围的细胞核，线粒体和植物叶绿体也具有自己的DNA。某些成熟细胞还会在分化过程中失去细胞核或大量核酸。因此，学习核酸时应把分子类型、所在结构和所处生命周期分开。这样既能认识共同的化学原理，也能理解不同生命系统为何有不同的组织方式。
糖、磷酸和碱基怎样组成有方向的链
核酸的基本单元是核苷酸，它由糖、含氮碱基和磷酸部分组成。糖加碱基叫作核苷，再带上磷酸才称为核苷酸。这里的“碱基”是这类含氮环状分子的名称，不表示整条核酸在水中呈碱性；事实上，骨架上的磷酸基团在常见水溶液条件下使核酸带有较多负电荷。DNA常用的四种碱基是腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胞嘧啶C和胸腺嘧啶T；RNA常用尿嘧啶U代替T。A和G具有相连的两个环，称为嘌呤；C、T和U的主要环系为一个六元环，称为嘧啶。
DNA中的糖是脱氧核糖，RNA中的糖是核糖。区别集中在糖的2′位置：RNA在那里带有羟基，DNA通常是氢。数字后的撇号用来区分糖上的编号与碱基上的编号；1′位置连接碱基，3′和5′位置参与主链连接。糖环并不是平整的五边形，会采用不同的起伏构象，碱基与糖之间也有可变化的相对方向。这些几何变化会影响链的形状，不能把书上画出的平面结构式直接当成分子在水中的固定姿势。
常见DNA和RNA主链都通过3′,5′磷酸二酯键相连：一个糖的3′氧与另一个糖的5′氧，经磷酸构成连接。磷酸上的两个酯连接把糖串在一起，碱基则像沿骨架伸出的侧面标记。链的一端称为5′端，另一端称为3′端，名称来自相应糖位置，不要求所有实际分子都具有完全相同的端基化学状态。通常书写核酸序列时，从5′端写向3′端；因此写出字母顺序时，方向本身就是信息的一部分。
想象一排带方向的插头，首尾相接以后，每一端能接什么仍然不同。细胞中的核酸聚合酶通常把新核苷酸接到生长链的3′羟基上，所以新链向5′到3′方向延长。模板则被沿相反方向读取。这里的方向不是分子在显微镜下朝左还是朝右，而是主链化学结构的方向。把图旋转一百八十度，分子的5′端与3′端不会互换。理解这一点，是读懂互补链、引物和翻译方向的基础。
RNA多出的2′羟基也不是一个无关紧要的装饰。它能参与氢键和折叠，在合适酸碱条件下还可参与攻击邻近磷酸，使骨架更容易发生断裂。DNA缺少这个羟基，因而在这类反应上具有不同稳定性。生物体也存在特殊的2′,5′连接、环状RNA和分支中间体；常见的3′,5′线性骨架描述的是主要形式，而不是排除所有其他化学结构。对于材料设计，正是这些小小的连接与糖结构差异，改变了保存时间、酶识别和组装方式。
双螺旋为什么能配对，又能够弯曲
把两条DNA链放在一起，并不只是让它们像两根绳子任意缠绕。常见的双螺旋中，两条骨架方向相反，碱基朝向内侧，糖与磷酸更多暴露在外侧水环境。A通常与T形成沃森—克里克配对，G通常与C配对。一大一小的碱基环系相配合，帮助维持较一致的横向尺寸，同时适合的氢键供体与接受体彼此对齐。于是，一条链的顺序给另一条链的顺序施加了明确约束。若上链写为5′-AGTC-3′，与它逐位配对的下链是3′-TCAG-5′；若也要把下链按5′到3′书写，就应写成5′-GACT-3′。
这也解释了经典的碱基数量关系：对于由标准配对组成的双链DNA整体，每个A对应一个T，每个G对应一个C。统计单独一条链时，A与T却未必相等；单链DNA或存在特殊配对的体系也需要另外分析。组成相同还不代表顺序相同。例如相同数目的A、T、G、C可以排成许多不同短链，像同一组字母可以组成不同单词。碱基组成帮助建立结构约束，真正携带更细致信息的是排列本身。
Franklin与Gosling在1953年的DNA纤维研究提供了理解螺旋和水合状态的重要衍射证据。同年Watson与Crick提出双螺旋模型，Wilkins及同事也发表了相关结构研究。X射线衍射不是把单根DNA直接拍成放大照片，而是让散射光波之间的干涉记录重复结构，再结合化学约束推断原子排列。纤维图样中的规则特征帮助判断螺旋尺度，碱基组成与合适的化学几何则约束配对方式。这个发现因此适合看作实验与模型相互限制的过程。
水合条件下常见的B型DNA直径约为2纳米，相邻碱基对沿轴方向的平均间距约为0.34纳米，溶液中每圈通常约含10.5个碱基对。纳米是一米的十亿分之一，小到普通光学显微镜不能直接分辨单个这样的间隔。实际DNA的局部扭转和弯曲随序列、环境及结合蛋白而变化；A型、Z型等结构也说明核酸没有唯一不变的螺旋几何。用平均间距计算长链的轮廓长度，能够建立尺度直觉，却并不等于它在溶液中两端相隔多远。
绕成双螺旋的两条骨架并没有把圆周均匀分成两半，碱基与糖连接的位置使表面形成宽窄不同的两道沟，称为大沟和小沟。沟内露出碱基边缘上的氢键供体、接受体以及其他化学基团，所以一些蛋白质能够在双链仍然配对时读取局部序列特征。沟的宽度与形状也随序列和环境变化。A型DNA、B型DNA通常为右手螺旋，某些条件下形成的Z型DNA则为左手螺旋；左右手描述沿螺旋轴前进时的旋转关系，并不改变主链自身的5′与3′方向。这样，字母顺序、链的化学方向和整体螺旋形状就成为三个需要分别辨认的层次。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| L | 双螺旋的轮廓长度 | nm |
| Nbp | 碱基对数 | 1 |
| h | 相邻碱基对平均轴向间距 | nm |
怎样理解沿轴重复许多近似相同的间隔，总长度就是间隔数量乘平均间距。长链用碱基对数近似步数；若严格量首末碱基对中心间距，则有Nbp−1个间隔。
算一个例子取B型DNA的h≈0.34 nm，1000个碱基对的轮廓长度约为340 nm，即0.34 μm。若严格数999个中心间隔，则为339.66 nm。
使用条件采用B型DNA的平均结构尺度；局部结构与环境可改变间距。轮廓长度沿链测量，不等于弯曲链两端的直线距离。
双螺旋稳定性来自多种作用的共同结果。碱基配对提供有方向的选择性，邻近碱基的堆积、与水的相互作用以及离子对负电骨架的屏蔽也很重要。GC丰富的链段在相同条件下常具有较高的熔解温度，但不能只用“三条氢键比两条多一条”预测所有序列：相邻碱基组合、链长、盐浓度和错配位置都会影响稳定性。双链还能在保持许多配对的同时弯曲，因为骨架上的键角和转动改变了局部方向。把DNA想成完全笔直的玻璃棒，会漏掉长链在细胞内卷曲、包装和受力响应的重要性质。
复制保留了什么：氮同位素标记实验的推理
双螺旋提供了一个很自然的复制设想：两条旧链分开，各自作为模板，得到与自己互补的新链。但从一个合理模型走到实验结论，还需要问旧材料最终分到哪里。若整个旧双链保留不动，旁边制造一个全新的双链，这叫全保留式设想；若两条旧链各进入一个子代双链，就是半保留复制；若旧链片段不断分散到新链之中，则是分散式设想。它们都可能让总量增加，却对旧原子的分布作出不同预测。
Meselson与Stahl在1958年的实验利用较重的氮同位素标记原有DNA，再让细胞在较轻氮来源的环境中继续生长。新合成的链因而较轻。DNA在氯化铯密度梯度中离心，经过充分时间后会停留在与其浮力密度相匹配的位置。这里比较的是密度，不是简单地认为分子越长就沉得越深。重重双链、重轻双链与轻轻双链对应不同位置，于是不可直接看见的链分配问题，转成了可以观察的条带问题。
第一轮复制后，半保留模型预言全部双链都含一条旧重链和一条新轻链，因而出现中间密度的条带。全保留模型则预言重条带与轻条带同时存在。仅看第一轮，还需要与某些分散式结果继续区分；第二轮提供了关键补充：半保留复制产生一半重轻双链和一半轻轻双链。随着复制轮数增加，含旧重链的双链数保持为最初旧链对应的数量，而总双链数继续增加，中间密度条带所占比例便逐轮减半。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| g | 转入轻氮环境后完成的复制轮数，取整数 | 1 |
| fHH, fHL, fLL | 重重、重轻、轻轻双链在全部双链中的比例 | 1 |
| H, L | 含重氮旧链与使用轻氮新合成的链的标记 | — |
| 2^(1−g) | 重复减半形成的指数；等于2除以2的g次方 | 1 |
怎样理解从一个重重双链出发，原有的两条重链各留在一个子代双链中。第g轮后总双链数为2的g次方，含重链的双链仍为两个，所以其比例为2除以总数。其余都是轻轻双链。
算一个例子第1轮，重轻比例为1，轻轻为0；第2轮各为1/2；第3轮重轻为1/4、轻轻为3/4。第0轮尚未复制，单独设重重比例为1。
使用条件理想同步复制模型，初始双链完全重标记，新链全部使用轻氮；不考虑重氮再利用、降解与不同复制进度混合。
H表示旧重标记链，L表示新轻链。纵向位置表示相对浮力密度；条带厚度用于示意比例。
比较第1轮与第2轮：哪些模型给出同样的第一轮结果，哪些在第二轮出现不同条带？分散模型采用每个分子均匀混合的理想化情形。
半保留描述的是旧链如何进入子代分子，并不表示复制工作只靠两条链自行分开就能完成。细胞中的解旋酶帮助打开双链，聚合酶负责选择并连接核苷酸，引发酶提供起始片段，连接酶把适当的缺口封合。因为新链通常只能向5′到3′延长，同一个复制叉两侧的合成安排不同：一侧可以相对连续地跟随复制叉前进，另一侧需要分段合成后再连接。这种不对称来自共同的化学方向规则，而不是两条模板遵循了不同的配对原则。
复制还需要选择和校正。正确配对更容易进入合适的反应几何，某些聚合酶的校对功能能够移除错配末端，细胞还有后续修复过程。罕见的碱基互变异构、损伤和其他因素仍可导致错误。因而遗传稳定性是多道分子过程共同作用的结果，而不是每一次氢键接触都绝对正确。少数序列变化可能被保留下来，其影响取决于发生位置、细胞处理和后续选择；不能把所有突变都等同于蛋白质完全失效。
RNA可以传信，也可以形成工作的结构
RNA常以单链形式参与细胞活动，但单链并不等于一根没有结构的松绳。同一条链上相距较远的互补片段可以靠近配对，形成茎环、凸起和更复杂的三维折叠。RNA还允许一些常见的非标准配对，例如G与U的摆动配对；局部稳定性由序列、离子、温度和整体结构共同决定，没有一个对所有RNA都适用的最少配对数。双链RNA也存在于一些生命过程和病毒基因组中，因此“DNA总是双链、RNA总是单链”只能作为非常粗略的初始印象。
信使RNA，简称mRNA，把一段可翻译的信息带到核糖体。研究者曾经需要区分两个可能性：细胞是否为每种蛋白质制作一种专用核糖体，还是同一种制造机器可以读取不同的临时信息？Brenner、Jacob与Meselson在1961年的实验追踪旧核糖体与新合成RNA之间的关系，支持新信息能够送到已有核糖体上的图景。于是，改变生产内容不必先重建整台机器，只需改变被读取的RNA。这也解释了为什么调节转录和RNA寿命能够较快改变蛋白质生产。
许多真核细胞的mRNA在成熟过程中获得5′帽子、经历剪接，并在3′端加上多聚腺苷酸尾。帽子具有特殊的5′—5′三磷酸连接，与普通主链连接不同；这些结构共同参与保护、运输和翻译调节。多聚A尾的长度会变化，也有不采用这类尾部的mRNA。基因转录区中的内含子通常在剪接时移去，保留在成熟RNA中的部分称为外显子。外显子可以包含不被翻译的区域，所以“外显子”等同于“编码氨基酸的片段”会混淆RNA加工与翻译这两个层次。
转运RNA，简称tRNA，是连接核酸语言与氨基酸语言的接头。它的一端具有能够识别mRNA密码子的反密码子区域，另一端通常通过成熟的CCA末端携带氨基酸。二维配对图常画成三叶草形，真正的三维结构则常呈L形。三叶草图说明哪些片段配对，L形结构说明这些片段在空间中怎样组合，两者不是互相竞争的解释。tRNA上的修饰碱基还能影响识别和稳定性，使这类短链拥有超出普通四个字母列表的化学细节。
典型tRNA的三叶草图可以沿一条连续的链读出来：5′附近与3′附近互补配对形成接受臂，3′端的CCA从这里伸出；另外三组茎环常称为D臂、反密码子臂和T臂，两臂之间还可有长度不同的可变区。D名称来自其中常见的二氢尿嘧啶，T臂的名字与核糖胸腺嘧啶、假尿嘧啶等修饰残基有关。反密码子环暴露用于读码的三个碱基，其他区域共同帮助折叠以及与合成酶、核糖体相认。D区与T区的空间接触使平面图中的远处片段靠拢，组织出L形转角；不同tRNA和细胞器中的变体可以缺少某些典型结构，因此这些部件是理解常见结构的起点。
核糖体RNA，简称rRNA，则构成核糖体的主要结构与催化核心。1982年Kruger、Cech等人的自剪接RNA研究帮助打破了催化功能只能由蛋白质承担的印象。随后对核糖体的结构研究进一步显示，负责肽键形成的中心主要由RNA组织。RNA因此同时展示了两种能力：它可以通过顺序提供可配对的信息，也能折叠成具有具体作用的形状。对生物大分子材料而言，这种“序列决定组装，组装产生功能”的关系尤其值得留意。
怎样看见核酸的数量、长度与配对状态
核酸溶液常常看起来清澈无色，因此需要把分子变化转成仪器能够记录的信号。碱基中的电子体系能够吸收紫外光，核酸在约260纳米附近具有明显吸收。让已知波长的光穿过溶液，比较进入与透过的强度，就可以定义吸光度。稀溶液中，更多吸收分子或更长的光程会让光损失得更多，因而可以用合适的吸收系数估计浓度。不同序列和单链、双链状态的系数并不完全相同，采用与样品相符的数值，是把光学信号转成数量的关键。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| A | 指定波长处的吸光度 | 1 |
| It, I0 | 透射光与入射光强度，使用同一单位 | 相同强度单位 |
| log10 | 以10为底的对数：求10需要乘方多少次才得到括号内数值 | — |
| ε | 所测序列与状态的摩尔吸收系数 | L mol⁻¹ cm⁻¹ |
| c | 该核酸分子的摩尔浓度 | mol L⁻¹ |
| l | 光穿过样品的距离 | cm |
怎样理解透射比例越小，对数越负，前面的负号使吸光度为正。稀溶液中相互独立的吸收贡献随浓度与光程增加，因此A与c及l成正比。
算一个例子假设某短核酸在260 nm的ε＝100000 L mol⁻¹ cm⁻¹，l＝1 cm，测得A＝0.20，则c＝0.20/100000＝2×10⁻⁶ mol L⁻¹，即2 μmol L⁻¹。此时透光比例约为63.1%。
使用条件样品需处于线性吸收范围，扣除溶剂背景，并采用匹配的序列与状态系数。散射和其他吸收物质需要另行处理。
吸光度只回答了一部分问题。蛋白质、游离核苷酸和某些其他物质也可能影响光谱，一段长DNA断成许多小片段后，紫外吸收仍然可能很明显。要检查长度分布，常用凝胶电泳：带负电的核酸在电场中移动，凝胶孔道对不同大小和形状的分子产生不同阻碍。对处在合适分离范围内的线性双链DNA，小片段一般移动较快，未知条带可以与相同胶中的长度标准比较。环状、超螺旋或部分单链分子的迁移还受到形状影响，所以不能把所有条带位置都直接解释为长度。
凝胶也像一张孔径可调的网，网过粗时很小的片段难以分开，网过细时较大的分子又难以通过。电场强度、温度和缓冲条件都会改变迁移与发热。RNA自身容易形成结构，分析其长度时常需要让不同分子处于相近的展开状态；保持样品不被核酸酶降解，则是另一项独立要求。将“去掉折叠”和“避免断链”分开，就能理解为何一种处理可能帮助读出真实长度，却不能替代清洁的操作环境和合适的保存条件。
离心测量还可从运动方式区分核酸与核糖体。速率区带离心比较颗粒在给定时间里移动多远，受质量、形状、水合及溶剂密度共同影响；前面复制实验的等密度离心则让样品接近平衡，比较最终停留的浮力密度。描述沉降快慢时，常把速度除以所施加的离心加速度，得到沉降系数，单位S称为斯维德伯，1 S等于10的负13次方秒。它不是分子质量单位，也不能把两个亚基的S值直接相加。常见细菌核糖体的30S小亚基含16S rRNA，50S大亚基含23S和5S rRNA，组装后称70S；典型真核胞质核糖体则由40S与60S亚基形成80S，其主要rRNA分别包括18S以及28S、5.8S、5S。名称中的数字记录沉降行为，具体组成仍要对应所研究的生物系统。
双螺旋受热后，碱基配对与堆积逐渐被破坏，两个链段能够分开，这称为熔解或变性。若骨架仍保持完整，分开与重新配对可以在适合条件下发生；骨架化学键被切断则属于降解，是另一件事。展开后的核酸常表现出更高的260纳米吸收，即增色效应。把吸光度随温度的变化画出来，可以观察配对状态如何改变，并在定义清楚的基线之间确定转变中点。不同序列、链长、盐和浓度下的曲线会不同，RNA也可以具有非常稳定的局部结构。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| T, Tm | 温度与所定义的熔解中点温度 | °C |
| A(T) | 温度T时的实测吸光度 | 1 |
| Ad(T), As(T) | 同一温度下双链与展开状态的基线吸光度 | 1 |
| u(T) | 按两条基线归一化的展开信号比例 | 1 |
怎样理解先减去完整双链基线，得到已经增加的信号，再除以从双链到展开状态的完整信号增量。比例为一半的位置定义光学转变中点。
算一个例子在某温度处，Ad＝0.40、As＝0.60，实测A＝0.50，则u＝(0.50−0.40)/(0.60−0.40)＝0.50，该温度就是这一分析定义下的中点。
使用条件将信号比例等同于分子展开比例，需要合适的两态及线性信号近似；多结构域或多状态体系可以出现多个转变。基线应随温度合理外推。
互补链重新相遇并配对称为复性或退火；来自不同分子的互补片段形成配对，则常称为杂交。其速度不仅取决于温度，还取决于浓度、链的结构和能否找到正确位置。快速冷却可能让某些结构被暂时困住，也可能允许短而合适的片段迅速配对，不能简单概括成“骤冷一定不能复性”。对材料设计来说，杂交提供了一种序列可选择的连接方式：不同构件携带互补片段时，可以通过配对组装；温度和溶液条件又能改变这种连接的稳定程度。
从基因到密码子：顺序怎样换一种语言
转录把DNA序列的信息转成RNA序列，翻译则把核苷酸顺序转成氨基酸顺序。前者仍在相近的核酸字母之间进行互补复制，后者需要一套把三联体与氨基酸联系起来的规则。对某一个转录单位，聚合酶使用一条DNA链作模板；在同一段染色体的不同位置，基因可以分别位于两种方向，因此不能说整条染色体永远只有一条链有转录功能。产生的RNA也不一定都是mRNA，rRNA、tRNA以及许多调节RNA都是转录的功能产物。
一段蛋白质编码基因还需要被正确启动、加工和停止。启动子是帮助转录装置选择起始区域和方向的DNA序列，转录起点是RNA开始生成的位置；起始密码子则是核糖体开始按氨基酸读码的位置，两者通常相隔一段会转录但不翻译的5′非翻译区。终止密码子之后也可有3′非翻译区，RNA合成的终止与蛋白质翻译的终止由不同信号和装置完成。远处调节序列可以影响转录，不必都被叫作启动子。常见细菌操纵子能把几个相关编码区转录到同一条mRNA，每个编码区仍有自己的翻译起止安排；许多真核mRNA主要编码一条多肽，而可变剪接又能从同一基因形成不同RNA。这些组织方式解释了为何基因不能按一个固定长度或“一段DNA只对应一种产物”来定义。
“中心法则”讨论的是逐残基的序列信息怎样传递。DNA可以复制为DNA，也可以转录为RNA；某些过程以RNA为模板合成DNA，称为反转录，还有以RNA为模板合成RNA的过程。Crick在1970年的说明特别强调，问题的核心是这种详细序列信息能否从蛋白质回传到核酸或另一条蛋白质，而不是把所有细胞活动都压成一条单向箭头。蛋白质能够调节转录、改变细胞状态，并不等于按自己的氨基酸顺序倒写出一条核酸序列。
一个密码子由三个连续核苷酸组成。为什么至少需要这样的长度？四种字母每一位都提供四种选择，一个位置只有四种组合，两个位置有十六种，三个位置则有六十四种，足以为二十种常见氨基酸和一些控制信号提供编码空间。这里的乘法表示独立位置的组合计数，并不表示自然界必然采用三联体；三联体读码还需要遗传学与生化实验确认。在标准遗传密码中，多个密码子可以对应同一种氨基酸，这叫简并性；三个常见终止密码子标记翻译停止，而不是编码三种额外氨基酸。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| k | 短串中的位置数，取正整数 | 1 |
| 𝒩(k) | 长度k的所有可能字母顺序的数目 | 1 |
| 4^k | 把四重复相乘k次 | 1 |
怎样理解每个位置都有四种选择，后一位置的每一种选择都能接在前面每一种排列后，所以用乘法组合。顺序不同的短串分别计数。
算一个例子k＝1时有4种，k＝2时有16种，k＝3时有64种。64种三联体提供足够的编码组合，但采用三联体读码这一事实由实验建立。
使用条件纯组合计数，允许四个字母在每个位置独立出现；不表示真实序列出现频率相等，也不保证某短串在基因组中唯一。
Nirenberg与Matthaei在1961年使用人工多聚U的实验展示了怎样从模板找到产物：向能够进行蛋白质合成的无细胞体系提供一类简单RNA，观察哪种氨基酸被大量并入新产物。多聚U推动形成富含苯丙氨酸的产物，把核酸排列与氨基酸选择建立起可测联系。完整密码表来自随后多种设计明确的实验，不能把组合计数当成破译本身，也不能把一个实验的成功写成所有对应关系已在当天确定。
阅读还需要起点。把同一串字母从第一位或第二位开始每三个分一组，得到的密码子可能完全不同，这就是阅读框。插入或删除一个核苷酸，通常会改变下游分组；替换一个核苷酸则可能改变一个氨基酸、保持氨基酸不变，或产生终止信号。由于密码表存在简并性，氨基酸顺序通常不能唯一反推出DNA顺序。天然系统中还有遗传密码变体和特殊重编码现象，读码规则应与所讨论的生物和细胞结构对应。把这些条件说清楚，才能理解为什么“同样长度的DNA”并不保证产生同样的蛋白质。
核糖体怎样把接头上的氨基酸连成链
这里会反复遇到ATP和GTP，它们分别是三磷酸腺苷和三磷酸鸟苷：核糖与A或G组成核苷，再在5′侧连上三个磷酸基团。名字中的“TP”表示三个磷酸；少一个称二磷酸，少两个称一磷酸。氨酰tRNA合成酶装载氨基酸时，ATP参与形成氨酰腺苷酸中间体并释放焦磷酸，也就是仍相连的两个磷酸基团；氨酰基随后转移到tRNA，释放一磷酸腺苷AMP。DNA聚合酶使用的则是四类脱氧核苷三磷酸，常合称dNTP，其中d表示糖缺少2′羟基，N代表不同碱基。它们既提供新链的构件，也通过反应中的磷酸转移参与连接过程。
翻译首先要把正确的氨基酸装到相应tRNA上。氨酰tRNA合成酶识别氨基酸和tRNA的结构特征，利用ATP参与的反应形成带氨基酸的tRNA。氨基酸通过其羧基与tRNA末端腺苷的糖羟基形成酯连接，之后进入核糖体。接头类比在这里变得具体：反密码子负责与mRNA相认，另一端携带待连接的氨基酸。若装载过程出错，单靠核糖体读对反密码子，并不能自动修正已经装错的货物，所以装载选择与编辑本身就是翻译准确性的重要环节。
ATP和GTP提供了把多个过程相互耦合的化学途径。讨论能量时，要看反应物转成产物的整体自由能变化，而不是说“剪断一根高能键便自动放出能量”。孤立地断开化学键需要能量，实际水解反应同时形成新的键，并改变水合、电荷与分子分布，整体才可能在相应条件下释放可利用的自由能。氨基酸装载保存了一部分反应势能，翻译中的GTP水解又与因子选择、构象变化和方向性耦合。这样理解，比把每一个肽键都想成由一个ATP当场直接推动更准确。
核糖体由大小两个亚基组成，结合mRNA和多个tRNA。常用A、P、E表示三个主要tRNA位置：A位点接纳新的氨酰tRNA，P位点携带正在增长的肽链，E位点与已卸载tRNA的离开有关。新氨基酸到位后，原来的肽链转移到A位点的氨基酸上，形成新的肽键；随后核糖体与mRNA的相对位置移动一个密码子，让增长后的肽链进入下一轮安排。A、P、E是连续工作的空间位置，不是三种不同的tRNA。tRNA会在不同状态间移动，核糖体也经历配合这些步骤的构象变化。
2000年Nissen等人的核糖体结构研究把催化中心的分子环境显示得更清楚：肽键形成区域主要由rRNA组织，而不是一个独立的蛋白质“肽酰转移酶”藏在大亚基里。核糖体蛋白同样重要，它们帮助整体组装、稳定和功能协调。这个结构事实将RNA的折叠能力与蛋白质制造联系起来，也让“RNA只是信息的临时纸条”这一印象显得过于狭窄。
起始步骤先把阅读框摆正，之后才进入重复的延长循环。许多细菌mRNA在起始密码子上游具有Shine—Dalgarno序列，它能与小亚基16S rRNA的一段序列配对，帮助定位起始位置；细菌也有采用其他起始方式的mRNA。专用起始tRNA将起始氨基酸放在P位点，常见细菌使用带甲酰基的甲硫氨酸，真核胞质翻译通常使用甲硫氨酸。这个先占据P位点的安排为A位点留下接纳下一个氨酰tRNA的空间。延长中，携带GTP的因子帮助递送和检查新tRNA，另一类因子参与移位；不同步骤分别控制识别和运动，所以一次正确配对并不等于整个循环已经完成。
链从哪一端长出来，也曾是实验问题。Dintzis在1961年研究血红蛋白链的装配时，向正在合成蛋白质的体系加入可追踪的氨基酸，并比较短时间内完成的链上不同片段的标记。若链从氨基端长向羧基端，许多已经造到半途的链只有后合成的羧基端片段会优先获得新标记；延长标记时间后，标记才更广地分布到整条链。这种时间与位置的配合，使“从N端向C端延长”成为可检验的结构推理。与之相关，若tRNA反密码子改变到能识别某个终止密码子，它有时能与释放过程竞争，让翻译继续；是否恢复功能还取决于插入的氨基酸和蛋白质位置，称为抑制型tRNA的作用，并不意味着原来的DNA突变消失。
mRNA通常按5′到3′方向读取，新多肽则从氨基端向羧基端延长。遇到合适的终止密码子时，释放因子参与识别并促使肽链与tRNA之间的连接水解，产物得以释放，核糖体随后回收再利用。细菌与真核细胞在起始识别、因子和细胞区室安排上有所不同；例如真核细胞的转录与胞质翻译通常由核膜分隔，而细菌中两者可以在时间上衔接。多个核糖体也可同时沿一条mRNA工作，各自制造一条多肽，形成多核糖体。新链还要经过折叠、定位和可能的化学修饰，才成为执行具体任务的成熟分子。
人工合成一条指定顺序的核酸
如果能够指定核酸顺序，就能制作寻找互补序列的探针、连接材料构件的短链，以及研究分子结构的模型片段。化学合成要解决的问题与细胞聚合不同：一个核苷具有多个可能反应的基团，怎样每次只在目标位置连接一种选定单元？保护基提供了暂时遮住某些位置的办法，固相载体则让生长链留在固定位置，便于清洗掉过量试剂。Khorana团队在1970年报道的tRNA基因合成展示了把化学制得的短片段借助互补配对与酶连接组合成较长DNA的思路。
早期磷酸二酯法与磷酸三酯法，都要把一个核苷酸的磷酸部分与另一个核苷的羟基定向连接。二酯法形成的连接仍保留一个可解离的磷酸位置；三酯策略在该位置加上可去除的保护基，改变中间体的电荷和后续反应行为。这里二酯、三酯数的是磷酸上通过氧连着有机基团的连接数。亚磷酰胺路线则先利用另一种更易活化的磷试剂完成偶联，再把所形成的亚磷酸酯氧化为磷酸酯。固相与液相说的是生长链是否固定在载体上，是操作组织方式；二酯、三酯与亚磷酰胺说的是连接化学，两类名称不应混成同一种分类。无论选哪条路线，临时保护最终都需按目标产物移除。
常见的固相亚磷酰胺化学把首个核苷的3′端连接到载体上，随后逐步向它的5′侧延长，因此其常规生长安排与细胞内聚合酶的延长方向不同。每个循环先露出可反应的羟基，再让活化单体偶联；没有成功延长的链端可以被封闭，减少它在后续循环继续参与而形成缺失序列；新形成的亚磷酸酯连接再经氧化转成更稳定的磷酸酯形式。最终还要移除保护基、从载体释放并分离产物。理解这些步骤的职责，比记住一串试剂缩写更容易看清合成为什么能按顺序进行。
Beaucage与Caruthers在1981年的亚磷酰胺研究推动了这种可控循环的发展。关键不是让所有基团都同时变得最活泼，而是使单体在需要时被活化，在其他阶段便于保存和处理。即使每一步都很有效，连续许多步后仍会积累未完成或错误产物。假定每次正确延长的概率相同，并暂时把其他损失分开，就能用重复相乘估计完整目标链的比例。这也是为什么长链合成不能只报告一个漂亮的单步效率。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| F | 该简化模型中的完整正确延长链比例 | 1 |
| p | 每一步正确延长的条件概率 | 1 |
| N | 目标链的核苷酸数 | 1 |
| N−1 | 从已固定的首个单元继续延长所需次数 | 1 |
怎样理解得到完整链需要每一次延长都成功。假定每一步成功比例相同，将这个比例重复相乘N−1次，就得到连续全部成功的比例。
算一个例子50个核苷酸需要49次延长。每步p＝0.99时，F＝0.99⁴⁹≈61.1%；若p＝0.995，F≈78.2%。细小的单步差别会在长序列中积累。
使用条件用于理解连续正确偶联；另有脱保护、释放、纯化及其他化学损失，实际分离收率还需计入这些过程。
提高单步效率、分离不同长度的产物以及验证序列，解决的是不同问题。分离能去掉一部分短链，但相同长度的错误序列可能仍需更具体的检测；把许多短片段按互补区组装起来，可以得到更长结构，却也需要检查错配、缺失和连接次序。这里并不存在一个对所有平台永远不变的最长可合成长度。链长、修饰类型、序列结构、化学路线和纯度目标共同影响可实现的产物，比较方法时应围绕这些实际条件。
核酸的互补性也提供了材料组装的连接规则。若几种短链分别设计有互补片段，就可以把不同构件组织成特定组合；某些区段形成双链，另一些保留为柔性连接或可识别末端。序列给出了局部配对偏好，浓度、盐和温度则影响能否到达所希望的组装状态。形成了一个预期长度的片段，还不等于已经得到全部预期的三维结构，结构测量仍然承担独立任务。由此，核酸既是遗传研究对象，也是一种可以利用顺序安排相互作用的高分子。
扩增让信号变多，验证让信息可信
有时需要的不是从单体重新合成一条链，而是把已经存在的某一段DNA复制出更多份。聚合酶链反应，简称PCR，利用两个短引物限定目标区域，通过双链分开、引物配对和聚合酶延长的循环实现扩增。引物既提供识别序列，也提供能够继续延长的3′末端，两条引物在相反模板上指向目标区域内部。经过最初几个循环，由两端共同限定的片段逐渐成为主要扩增对象。这个几何关系解释了为什么随意选两个能粘上DNA的短链，并不能保证扩增出所希望的区域。
耐热聚合酶使反复升降温的过程更容易持续。Saiki等人在1988年的研究展示了耐热DNA聚合酶在PCR中的作用，推动了循环操作与应用的发展。耐热性解决的是酶经历高温后继续工作的能力，准确性则涉及选择正确核苷酸和校对的能力，两者并非同一个属性。Taq聚合酶天然缺少常见的3′到5′外切校对活性；其他聚合酶具有不同性能。研究中应围绕长度、序列、所需准确性和后续用途选择合适体系，而不是把一种酶的早期范围写成PCR的永久边界。
若每个循环都把可扩增模板变为两倍，重复循环就产生指数增长。指数是重复乘法的简写：每一轮都乘同一个增长因子，轮数写在右上角。实际每轮增加量可能少于原有量，后期还会因组分消耗、产物积累和酶状态改变而进入平台。下面的模型把早期有效增加比例设为常数，用来理解不同效率怎样逐轮积累；它不把无限增长当成真实反应的结局。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| N0, Nn | 起始与第n轮后的可扩增分子数 | 1 |
| n | 循环次数，取非负整数 | 1 |
| E | 每轮新增数量相对于原数量的比例 | 1 |
| y | 图中扩增倍数的十进对数 | 1 |
| log10 | 以10为底的对数；纵轴增加1代表倍数再乘10 | — |
怎样理解每轮保留原有数量并新增E倍，所以总量乘以1＋E；重复n轮给出指数。取对数把多次乘法变成相加，便于同图比较差别很大的数量。
算一个例子E＝1表示每轮翻倍，10轮为1024倍。E＝0.90表示每轮乘1.9，10轮约为613.1倍，30轮约为230466618倍；理想翻倍30轮为1073741824倍。
使用条件恒定效率、尚未出现平台的增长模型；真实PCR随循环可改变效率，最初产物形成和低拷贝随机性也会影响观察。模型倍数可以不是整数。
纵轴按十倍分级，同样的竖直距离代表同样的倍数变化。实线为设定效率，虚线为每轮翻倍；模型不包含平台。
先固定10轮改变效率，再固定效率改变轮数，观察重复乘法怎样积累差别。
扩增很多与扩增正确需要分别判断。背景分子若具有足够匹配的引物结合位置，也可能被一起放大；模板上的损伤、复制错误和样品带入的微量分子都会影响后续结果。用不含模板的对照检查试剂背景，用具有已知结果的对照检查体系是否有效，再用长度、特异识别或序列测量确认产物，可以分别回答不同问题。引物的特异性也不能仅靠“随机四字母序列里某短串应当很少见”来保证，因为真实基因组具有重复、组成偏好和相近序列，配对还可能容忍部分错配。
几种引物策略是在不同信息条件下作出的选择。只知道某段蛋白质的氨基酸顺序时，密码的简并性使对应DNA可能有多种写法；简并引物把若干候选寡核苷酸配成混合物，以覆盖这些可能性，同时也稀释了其中每一种精确序列的浓度。嵌套PCR则先用外侧引物扩增，再用位于该产物内部的另一对引物重新选择：目标必须连续满足两组位置关系，通常能提高选择性，但两轮之间的转移也需要控制带入污染。热启动体系把聚合酶活性延迟到合适的加热阶段，减少低温准备时发生的不合适延长。这些方法分别改变候选序列覆盖、二次位置筛选和反应启动时间，所得产物仍通过长度与序列等证据确认。
从DNA的结构到PCR，可以看到同一个关系不断出现：互补配对提供选择性，主链化学决定方向与稳定性，酶和环境决定过程怎样发生，测量则把分子变化转成可判断的证据。RNA的折叠和核糖体的工作又说明，保存信息的链也能成为有功能的结构。读懂核酸，不只是记住四个字母与几条箭头，而是能够沿着这些关系解释一个具体结果：看见了什么分子、它怎样形成、什么决定了它的数量，以及它是否仍保留需要的序列和功能。