怎样改变蛋白质而保留功能：化学修饰与连接

给一台分子机器装上可见的把手

在显微镜下寻找一种蛋白质，有点像从拥挤车站里寻找一位没有明显标记的乘客。蛋白质本身往往没有足够独特的可见信号，因此可以给它接上荧光分子，让照明后的发光位置帮助我们追踪它。另一个场景发生在材料表面：把能够加快特定化学反应的蛋白质催化剂——酶——接到小颗粒上，反应结束后便可以把颗粒与液体分开。两种用途都需要给蛋白质增加一个“把手”，但把手不能挡住它原来需要工作的部位，也不应使它失去合适的形状。蛋白质化学修饰研究的就是如何选择位置、建立连接，并读懂连接带来的变化。

蛋白质是一条或多条氨基酸链折叠而成的结构。主链像连续骨架，侧链则提供带电、疏水、能够形成氢键或参加化学反应的局部区域。折叠把顺序上相距很远的片段放到一起，组成结合口袋、催化中心和连接界面。这里将化学修饰主要用于指对蛋白质建立、改变或切断共价连接。吸附一个小分子、改变酸碱度或暂时结合金属离子，也能改变蛋白质状态，但它们与形成持久标签的化学过程具有不同的连接性质，需要分别描述。

一个标签至少有两个功能部分：负责与蛋白质反应的连接端，以及负责发光、吸附、定位或提供其他功能的报告端。两端之间还可以有一段连接臂，把较大的报告端与蛋白质表面隔开。把标签想成带绳的行李牌很直观：绳结的位置影响能否系牢，绳长影响牌子会不会遮住把手，牌子的大小则影响物体怎样运动。真实分子还涉及电荷、溶剂和热运动，所以同样的连接化学，换一个较大的染料或较疏水的标签，也可能改变蛋白质的溶解性和结合行为。

修饰可以用来观察，也可以用来提问。若某个基团暴露在表面，试剂容易接近，它的反应通常比埋藏基团更容易被观察；若蛋白质结合另一分子后，该位置受到遮挡，标记速度可能改变。通过比较结合前后的反应，我们可以获得关于空间变化的线索。若修饰后催化活性下降，则应进一步区分催化基团被直接改变、底物通道受到遮挡以及整体结构改变这几种情形。把位点鉴定、结构测量与功能测量安排在一起，才能将一个结果落实到具体机制。

许多经典方法的价值正在于把难以看见的分子问题变成可测的信号。早期的端基标记帮助读出蛋白质顺序，显色试剂让研究者能数出可接近的巯基，双功能连接剂则记录曾经彼此靠近的区域。今天的选择性连接继续沿着这条思路发展，同时增加了对位置、时间和细胞环境的控制。理解这些方法，不必先记住一长串试剂名称；更重要的是始终追问三个问题：哪个基团发生反应，为什么这个位置更容易反应，以及测到的信号具体代表多少、什么状态的分子。

选择反应位置：化学种类、酸碱度与空间

先从最常见的反应基团认识蛋白质表面。赖氨酸侧链末端有氨基，半胱氨酸带巯基，天冬氨酸和谷氨酸带羧基，酪氨酸带酚羟基，组氨酸带咪唑环。这些名称描述原子怎样连接，也提示它们怎样交换质子或电子。亲核基团能够提供一对电子，与适合接受电子的反应位置建立新键。氨基和巯基在合适状态下可以参与这类反应；其他残基还可以通过氧化、芳香环反应或专门设计的连接方式被改变，因此可修饰的位置并不限于一个简单的“极性残基”名单。

“选择某一类基团”和“选择某一个位置”是两层不同的选择性。某种试剂主要与氨基反应，一条蛋白质上却可能有十几个赖氨酸和一个游离氨基端；它能分辨化学种类，并不意味着能认出其中唯一的赖氨酸。位置选择还受到周围环境影响：相邻带电基团改变局部电性，氢键改变质子状态，口袋深度决定试剂能否进入。可以把这些因素理解为门的材质与门的位置：钥匙先要适合门锁，而门是否被遮住、能不能靠近，也决定实际能否开门。

酸碱度通过质子状态影响反应性。质子是氢原子失去电子后剩下的带正电粒子；水溶液中的酸碱平衡控制某个基团接上或释放质子的倾向。氨基带着额外质子时通常不如未质子化形式容易作为亲核体，巯基失去质子后形成硫负离子，常具有更强的亲核反应能力。pH衡量环境酸碱状态，pKₐ描述某个基团两种质子状态达到相等比例的位置。pH与pKₐ的差，决定一类可反应形式占总数的比例。

假设某个可接近巯基的pKₐ为8.3，在pH7.3时，其去质子化比例约为9.1%；pH8.3时为50%；pH9.3时约为90.9%。这并不意味着把pH不断提高就能获得最佳标记：蛋白质自身的电荷网络也在变化，其他基团可能开始竞争反应，某些标签还会更快地与水反应失效。实际的选择需要同时考虑反应速度、蛋白质状态和试剂寿命。pKₐ也不是每个半胱氨酸都相同的常数，蛋白质中的局部环境可能让某个位置明显偏离常用参考值。

空间可接近性带来另一组实验问题。一个柔性、小体积的标签可能进入狭窄区域，而较大标签会被挡在外面；同一位置在蛋白质开合过程中还可能短暂暴露。缓冲液中的其他成分也参加了这个环境，例如带游离氨基的缓冲组分可能与胺反应试剂竞争，残留还原剂可能消耗用于巯基的试剂。设计时可先画出所有可能反应的成分，再选择与目标反应相容的环境。这样，“温和条件”就有了具体含义：让目标蛋白质保持所需状态，并给期望的反应足够机会。

用巯基把结构变化变成颜色

半胱氨酸的巯基由硫和氢组成，常写作—SH。两个巯基氧化后可以形成—S—S—二硫键，把链上两个位置连接起来；还原则可以把二硫键重新变成两个巯基。因此，测量“自由巯基数”与测量“半胱氨酸总数”是不同任务。某些半胱氨酸已经参与二硫键，某些自由巯基埋在内部，某些还处于其他氧化状态。先说明测量对象，颜色变化才有明确的分子含义。

1959年，Ellman发表了利用显色反应测量巯基的研究。常称为Ellman试剂的DTNB含有可参与交换的二硫键。一个巯基与它反应后，形成混合二硫键，并释放能产生明显可见吸收的TNB组分。在适当条件下，每反应一个巯基可对应一个显色产物。于是，无形的反应次数被转成了溶液颜色的深浅。图中的颜色只是帮助理解读数，真正的测量是在指定波长用仪器记录吸光度。

算例中，扣除空白后的412纳米吸光度为0.283，光程1厘米，采用与测量条件相符的摩尔吸收系数14150升每摩尔每厘米，可算得TNB浓度20微摩尔每升。若同一最终溶液中的蛋白质浓度为5微摩尔每升，则平均每个蛋白质分子对应4个已反应巯基。摩尔是对大量分子计数的单位，一摩尔约有6.022×10²³个实体；这里把两种摩尔浓度相除，就等于把显色分子总数除以蛋白质分子总数。空白、光程和最终稀释体积因此都直接进入答案。

显色系数也有自己的测量历史。1979年的Ellman试剂再检验对显色产物进行了纯化和定量研究，给出了常用水溶液条件下更精确的系数。酸碱度会改变TNB的离子状态，盐、变性剂和仪器条件也需要匹配。若溶液中还含有会与DTNB反应的小分子，吸光度就包含它们的贡献。使用相同环境的空白和合适标准物，能让读数与蛋白质上的目标基团对应起来。

巯基测量还可以比较结构状态。天然折叠状态下较快反应的巯基通常更易接近；展开后出现额外反应，说明原先受遮挡的基团获得了接触机会。若先将二硫键还原，再清除会干扰显色的还原剂，便可研究另一类计数问题。1964年Cleland介绍的二硫苏糖醇DTT把两个巯基放在同一个小分子上，还原过程中形成有利的环状氧化产物，帮助推动交换。这个设计展示了分子几何怎样影响反应的方向，而不是只靠增加试剂用量。

还原、标记和功能保持需要按目的安排。若要测定链上所有可转成巯基的半胱氨酸，可以把展开与还原纳入分析过程；若要保留抗体或酶的原有结构，则需要识别哪些二硫键参与稳定结构，再选择目标位置。还原后形成的巯基可能重新氧化，后续封闭能将状态固定下来，但也会永久改变这些位置。先区分“分析组成”和“制备功能产物”，就能理解为什么同一种化学变化在两个任务中需要不同的终点。

把标签与蛋白质连接起来

把染料接到蛋白质上，常使用能够与氨基反应的活化酯。酯是一类含有特定碳氧连接的化合物；“活化”表示其中一个部分较容易离开，使氨基有机会与酰基形成稳定的酰胺连接。NHS酯是一种常见形式，其中NHS表示N-羟基琥珀酰亚胺相关的离去部分。反应可以作用于可接近的赖氨酸氨基和游离氨基端。水也会与活化酯反应，使标签失去原本的连接能力，因此溶液中同时存在目标连接与水解两条竞争路线。

巯基连接提供另一种选择。碘乙酰胺类试剂可以让硫亲核体取代一个易离去的基团，形成碳硫连接；马来酰亚胺类试剂则让巯基加到电子不足的双键上。两类反应都能用于半胱氨酸，但产物结构与后续稳定性不同，马来酰亚胺连接在某些环境中还会发生交换或环结构变化。挑选连接方式时，可以把位置、反应速度与产物在后续环境中的寿命一起考虑。若需要长时间留在含有其他巯基的体系里，连接本身的稳定性便成为需要实测的性能。

羧基与氨基之间也能建立酰胺键，但二者在水中相遇并不会自动高效连接。羧基需要先获得适合反应的活化状态。水溶性碳二亚胺试剂如EDC能够帮助这一过程，随后氨基进攻形成酰胺，活化试剂自身转成其他产物。所谓“零长度交联”是说最终没有额外的交联剂骨架插在羧基与氨基之间，并不表示反应中没有加入试剂。若蛋白质自身同时具有多个羧基和氨基，连接既可能发生在两个分子之间，也可能在同一分子内部发生，产物分布取决于接近关系和条件。

其他残基也提供了观察结构的机会。组氨酸咪唑环能够交换质子并参与催化或配位，可用合适试剂探测其可接近状态；酪氨酸的酚羟基与芳香环能通过不同反应改变，二者的产物稳定性也不同；精氨酸的胍基常带正电，可以参与识别带负电的分子；色氨酸的芳香结构提供自身荧光，其环境改变会影响光学响应。把一个残基的信号用于判断功能时，需要明确反应究竟发生在哪里，并用分离和质量分析将具体位点找出来，而不是让一个试剂名称代替位点证据。

反应分类也帮助理解连接留下了什么。酰化把酰基接到目标基团上，烷基化建立相应的碳基连接，芳香亲核取代发生在适合被进攻的芳香体系，氧化还原则改变原子的电子状态。例如，Sanger试剂与氨基的连接属于芳香亲核取代，不能因为它也“给氨基加了东西”就统称为烷基化。对蛋白质而言，这些变化不仅改变质量，还可能改变电荷、疏水性、氢键和空间体积。把反应产物画出来，往往比只记录“已修饰”更能解释后续行为。

一种实用的设计顺序，是先选择蛋白质上想保留不动的区域，再寻找可以承载标签的位置。若结合口袋附近需要开合，较长连接臂也许能让报告端离开这个区域；若要在表面固定酶，最好让主要进出通道朝向溶液。之后再选择能够与该位置连接的化学端，并检查缓冲环境是否兼容。顺序如此安排，化学反应就服务于功能目标，而不会变成看到哪个基团容易反应就随意把标签接上去。

从一个端点读出一条链的顺序

在不知道蛋白质顺序的年代，研究者面对的难题类似于把一串相连的珠子完全拆散之后，如何恢复原来的排列。测量拆散后的氨基酸组成可以知道有多少种珠子，却失去了先后关系。一个有用的办法是在拆散之前，先给链的起点做上能够保存的标记。1945年Sanger的胰岛素游离氨基研究正是沿着这一思路，将氨基与可识别的化学基团连接，再分析水解后的产物，为认识链端结构提供线索。

蛋白质的氨基端带有可反应的游离氨基，但赖氨酸侧链也有氨基。因此，端基分析包含两步判断：先建立连接，再识别分离出的衍生物具体属于链端还是侧链。标签与目标的连接要能在后续处理后留下可辨认产物，分离方法则帮助把不同衍生物区分。这个例子说明“试剂只看见一种官能团”与“实验最终能分清不同位置”并不矛盾，选择性可以来自反应和后续分离的组合。

逐个读出顺序还需要另一项设计：切下第一个残基时，让剩余链继续完整地保留。Edman在1950年的肽序列测定方法中建立了可以循环进行的端基化学。先让苯异硫氰酸酯与游离氨基端反应，再通过特定的环化与断裂过程移去首个残基，最后把它转成适合鉴定的稳定衍生物。剩余链露出新的氨基端，下一轮便读出第二个残基。方法的精妙之处，是将反应位置限制在已被标签改变的端部附近。

循环方法会积累不完整反应的影响。若少数分子在某一轮没有成功前进，下一轮的产物就可能与主要队伍错开一步；同时还会发生样品损失和背景积累。因此，实际能读多长取决于样品状态、每轮效率和检测能力，而不是一个对所有蛋白质都适用的固定残基数。若氨基端本来被封闭，反应入口也会改变。较长蛋白质可以先得到不同的重叠片段，再利用片段间共同顺序把信息拼接起来，这与只读一条无限长链的任务不同。

荧光端基标签提高了某些分析的检测能力，质量分析则提供了另一套识别分子和片段的方式。不同方法各自记录化学变化留下的信息：颜色或荧光告诉我们某类衍生物出现了多少，质量差帮助区分连接了什么，碎片信息则帮助定位连接位置。科学史中的这些方法能够延续到今天，是因为它们把一个难题拆成了清楚的步骤：建立有意义的化学差异，将产物分开，再把测量结果还原成结构关系。

修饰得多快，功能又怎样改变

只有反应前后的两个时间点，往往看不清蛋白质经历了什么。若连续测量，可发现某些基团很快被修饰，另一些缓慢变化，功能下降又可能发生在不同阶段。1961年Ray与Koshland的定量化学修饰研究将基团变化速度与活性变化联系起来；邹承鲁随后发展的统计处理，则从修饰程度与剩余活性的关系提问。两种思路都把“加了试剂以后活性变了”推进到更具体的问题：哪一类反应过程能够解释功能变化的数量关系。

先看一个容易理解的动力学模型。修饰试剂很多，蛋白质上目标基团很少，反应消耗的试剂只占其总量很小一部分，因此可以把试剂浓度近似看成不变。每个尚未反应的基团，在单位时间内遇到并成功反应的机会近似固定，于是剩余未修饰比例按指数减小。这称为伪一级过程：“一级”指变化速度与剩余目标量成正比，“伪”提醒我们，原本还依赖试剂浓度，只是该浓度在这次实验中近似恒定。

若观察到两段明显不同的变化速度，可能是表面与内部位置的可接近性不同，也可能是反应本身促使结构改变后暴露了新位置。还需要检查试剂是否逐渐水解、蛋白质是否聚集以及读数是否混入了另一种产物。可以通过改变试剂浓度、测量完整时间过程、分离修饰产物和比较结构信号来区分这些解释。这样，每一个额外实验都对应一个具体的因果问题，而不是单纯让图上的点更多。

再看剩余活性的统计含义。假设一种蛋白质有若干个同样容易被修饰的位置，其中有m个位置只要任意一个被修饰，该分子就失去所测功能。若各位置独立反应，单个位置保持未修饰的概率为q，那么所有m个关键位置都保持原状的概率就是q连续相乘m次。在这些条件下，样品平均剩余活性便与这一概率相同。这个推导把“多个位置都要保留”转成了概率的乘法，也让我们看到模型假设怎样决定曲线形状。

例如q为0.8时，一个关键位置对应80%剩余活性，两个都必须保留的位置对应64%，三个对应51.2%。如果实际蛋白质的某些修饰只降低而不完全消除活性，或者不同位置反应速度不同，就要改用与这些情形相符的模型。对一个带多个亚基的酶，还要弄清各亚基能否独立工作。定量曲线因此是一种连接实验与机制的工具：先明确“什么变化会怎样影响功能”，再检验曲线是否支持这一结构关系。

底物保护实验提供了另一条互补线索。先让蛋白质结合底物或合适配体，再观察某个位置是否变得不易修饰，能够帮助判断该位置与结合区域的关系。保护可能来自直接遮挡，也可能来自结合引起的构象变化；将标记位点、结合测量和结构响应放在一起，可进一步区分两者。通过这种安排，功能测试不只是修饰前后的一项附加读数，而是与化学位点和时间过程共同构成解释的核心。

让结合引导反应，再设计专用接口

如果一条链上有许多相似基团，单靠基团化学很难选择唯一位置，可以让分子识别先把试剂带到附近。亲和标记试剂通常包含能够与目标结合的部分和能够建立共价键的部分。识别部分进入合适口袋后，提高了反应端在局部的停留机会，从而增加附近基团被连接的可能性。这类似先找到房间，再在房间里完成固定。观察标记随试剂浓度趋于饱和，或被天然配体竞争，可以帮助理解结合步骤对结果的贡献。

光亲和标记增加了时间控制。试剂可以先在较低反应性的状态下与目标相遇，再用光触发短寿命活性中间体，使附近位置被连接。不同光反应基团产生的中间体不同，例如某些体系涉及卡宾，另一些涉及氮烯，不能统称为同一种自由基。由于中间体寿命短，反应常记录触发时的局部邻近关系；但被连接到的区域也受到试剂位置、连接臂长度和反应对象的影响。结合竞争、无光对照和位点鉴定共同帮助把“发生了连接”解释成具体的接近关系。

还有一类试剂利用酶自己的催化过程生成反应性中间体，通常称为机制依赖抑制剂。酶先把它当作能够进入反应途径的分子处理，随后形成的活性物种又与酶反应，使功能改变。它与一般的“先天很活泼的试剂撞上蛋白质”不同，选择性的一部分来自酶所执行的化学步骤。研究这类过程时，要把结合、转化和共价改变按先后分开测量，才能说明究竟是催化中的哪一步提供了定位机会。

另一条路线是给目标加入细胞常见分子中很少使用的专用反应接口，让后来的标签主要寻找这个接口。2000年Saxon与Bertozzi的改造Staudinger连接研究将叠氮基与专门设计的膦试剂连接，用于细胞表面的化学标记。2004年，Agard、Prescher与Bertozzi的环张力促进连接研究进一步利用受张力的炔与叠氮基反应，扩展了在生物环境中进行选择性连接的方式。这些工作把问题从“在已有基团中寻找少数例外”推进到“先安排一个可辨认接口”。

生物正交描述的是目标反应与周围生物化学之间具有较少交叉反应的设计。它仍要通过反应速度、空间可接近性、产物稳定性和生物状态来评价。接口可以通过合成、酶促连接或设计的生物合成方式加入，标签则在后续接上；这样可以把“接口放在哪里”和“后来接什么报告端”分成两个步骤。对功能材料而言，这种分工尤其方便：同一位置可以连接染料、表面锚定分子或其他功能组分，同时分别比较它们对蛋白质行为的影响。

平均一个标签，不等于每个分子一个

假设一批蛋白质平均每个分子接上一个染料，直觉容易画出整齐的一排分子，每个都带一个点。随机修饰通常产生另一幅图景：一些分子没有接上，一些恰好一个，另一些已经接上两个或更多。平均值把这些差异压成了一个数。对成像而言，标签分布影响亮度差异；对连接功能分子而言，它还影响大小、电荷和结合行为。因此，平均修饰程度与分布形状是两个都值得知道的信息。

可以用一个明确的概率模型观察这种差别。设每个蛋白质有n个等价、相互独立的位置，每个位置以概率p被修饰。恰好出现j个标签，需要选出哪j个位置反应，再乘上这些位置反应、其他位置不反应的概率。选择方法的数量由组合数给出；把所有可能的选择相加，就得到二项分布。所谓独立，是指某个位置是否反应不会改变其他位置的概率；真实蛋白质可能偏离这一点，但这个模型能清楚显示平均数怎样掩盖分子之间的差异。

当n为10、p为0.10时，平均标签数正好为1，但无标签分子约占34.9%，恰好一个约占38.7%，两个及以上约占26.4%。提高反应程度会减少无标签分子，也会增加多标签分子。若真正需要每个分子都在同一个位置恰好接一个标签，通常应从唯一可反应接口、位点选择和产物分离入手，而不是只把试剂量调到“平均一个”。交互图让这组分布随参数变化，把抽象概率转成可以直接比较的柱形面积。

实验中的平均标记数常通过吸光度估计。染料在某个可见波长有明显吸收，蛋白质常在280纳米有自身吸收，但染料也可能在280纳米贡献一部分信号。先扣除染料贡献，再计算蛋白质浓度，最后用染料浓度除以蛋白质浓度，才得到可解释的平均连接数。游离染料需要先与蛋白质分开，否则它也会增加染料读数；聚集与散射也会影响吸光度。这个测量过程把纯化、光谱和计数连接在一起。

平均值以外，还可以通过完整分子的质量变化观察不同标签数的组分，再把蛋白质切成肽段、分析哪些片段发生质量变化，从而定位修饰位置。完整质量回答“接了多少”，肽段定位回答“接在哪里”，功能测量回答“连接后还能做什么”。三种信息共同描述一个产物，比只用明亮的荧光或较高平均标记度评价修饰更接近应用真正需要的结果。

把修饰后的蛋白质变成可用材料

把酶固定到颗粒或薄膜上，可以让催化功能留在指定位置，方便回收或构建连续流动的反应表面。连接方法可以是吸附、包埋或共价固定，各自改变酶与周围环境的联系。共价固定通常使连接更持久，但连接位置和数量会影响酶的开合与底物进入。一个靠近活性口袋的大颗粒，可能像把工具的工作端贴在墙上；在远离口袋的位置设置连接臂，则更有机会让功能面朝向液体。因而，固定是否成功需要同时看连接量和可使用的功能。

表面上的酶也不再处于与均匀溶液完全相同的环境。底物先从液体中扩散到表面，再穿过可能存在的涂层或孔道，最后才到达结合位置。如果输送速度慢，即使酶本身仍然高效，整体反应也可能表现得很慢。增加固定酶的数量，可能只让更多酶竞争有限的底物供应。比较不同表面时，可以改变搅拌、流速或颗粒尺寸，观察速率是否随物质输送改变，再与游离酶的响应比较，将运输与分子催化的贡献分别识别。

交联还可以把多个蛋白质或蛋白质与高分子网络连接成材料。双功能试剂的两个反应端可能连接同一分子内部，也可能桥接两个分子；反应端的种类与间距决定能够捕捉怎样的邻近关系。交联用于结构研究时，连接提供距离与可接近性的约束；用于制备凝胶时，足够多的跨分子连接使网络贯穿整体。某个连接被观察到，说明反应端在相应时间与条件下达到了可连接状态，理解它还需要考虑连接臂的柔性与蛋白质本身的运动。

完成一种修饰材料，可以沿一条具体的测量链前进。首先确认连接产物与游离试剂已经分开，然后测量平均修饰程度和主要分布，接着鉴定关键连接位置，并检查蛋白质是否维持所需的分散或组装状态。功能测量应对应实际用途：成像关注信号、定位和标记后行为，固定化酶关注可接近的活性与循环使用，结构探针关注状态变化与位点响应。这样，化学产率不再是唯一终点，而是进入可用功能的第一步。

设想要制备一种能识别目标的荧光蛋白质探针。可以先选择远离结合区域的连接位置，让报告端通过合适连接臂伸到溶液中，再比较不同标记程度下的结合能力、亮度和分散性。若提高标签数量后亮度增加而结合下降，下一步可以缩小报告端体积、改变连接位置，或改用单一接口，而不是继续增加试剂。这个例子贯穿了本章的所有层次：分子基团决定能否连接，局部环境决定在哪里反应，分布决定产物有多一致，功能测量决定这种改变是否服务于用途。